腺苷A2A受体在孕期酒精暴露抑制新生大鼠RRDA中的研究

齐亚杰巩宪宇胡冰冰（ 周口市中心医院呼吸内科，河南 周口 466000； 新乡医学院三全学院，河南 新乡 45000； 新乡医学院第三附属医院，河南 新乡 45000）

腺苷A2A受体在孕期酒精暴露抑制新生大鼠RRDA中的研究

齐亚杰1巩宪宇2胡冰冰3
（1 周口市中心医院呼吸内科，河南 周口 466000；2 新乡医学院三全学院，河南 新乡 4530003；3 新乡医学院第三附属医院，河南 新乡 453000）

目的 探讨腺苷A2A受体在孕期酒精暴露中所致子代呼吸抑制中的作用机制。方法 使用电生理方法研究腺苷A2A受体在孕期酒精暴露抑制子代延髓呼吸中枢基本节律性呼吸放电（rhythmic respiratory discharge activities，RRDA）中的作用，使用Western blot和qRT-PCR检测延髓呼吸中枢面神经后核内侧区神经元腺苷A2A受体（adenosine A2Areceptor）以及受体mRNA表达的变化。结果 腺苷A2A受体参与孕期酒精暴露对子代延髓呼吸中枢抑制作用，孕期酒精暴露降低腺苷A2A受体功能。结果表现为酒精暴露组延髓面神经后核内侧区神经元腺苷A2A受体水平表达下调，P＜0.05，有统计学意义。结论 下调腺苷A2A受体和受体mRNA表达而降低腺苷A2A受体对RRRDA的调节作用可能是孕期酒精暴露抑制子代延髓中枢呼吸功能的机制之一。

腺苷A2A；酒精暴露；新生大鼠；RRDA

腺苷A2A受体（adenosine A2Areceptor）在中枢神经系统内广泛分布，与突触传递、神经元兴奋、运动调节等作用密切相关，参与多种生理和病理学过程［1-2］。酒精暴露能显著抑制神经细胞、星形胶质细胞、神经元类似细胞的增殖、大大降低细胞的存活率。导致DNA损伤引起细胞凋亡，进而使损伤中枢神经系统，基本节律性呼吸起源于延髓呼吸中枢，而稳定的节律性呼吸是稳定机体功能的根本条件。腺苷A2A受体在脑内广泛分布，参与中枢性呼吸放电活动的发生。延髓呼吸中枢部位的病变是临床工作中的常见病与多发病，酗酒引起的中枢性呼吸异常多见。分析延髓呼吸中枢基本节律性呼吸放电、腺苷A2A受体蛋白及基因表达等实验结果来探讨孕期酒精暴露抑制子代延髓呼吸中枢的机制，为临床预防和治疗提供思路和实验依据。

1　材料与方法

1.1实验动物：SPF级Sprague-Dawley成年大鼠购自郑州大学实验动物中心使用其0～3 d的新生大鼠，雌雄不拘。对照组新生大鼠自然喂养；酒精暴露组自合笼至分娩、哺乳期以8%的酒精为唯一饮用水的成年大鼠。

1.2新生大鼠离体延髓脑片基本节律性呼吸放电：按照Suzue方法制作离体延髓-脊髓标本。BL-420F智能型生物信号采集和处理系统进行处理、记录和分析。所记录到由脑片产生的RRDA反映了延髓呼吸中枢呼吸功能，将CGS21680和SCH58261分别先溶于10%DMSO，之后用ACSF稀释，稀释后使CGS21680的终浓度为20 nmol/L，SCH58261的终浓度为40 nmol/L，DMSO的终浓度不超过0.1%。实验分2组，分别为对照组，酒精暴露组，每组6只脑片。

1.3Western Blot检测受体蛋白表达：常规提取总蛋白，蛋白浓度测定，校正浓度，常规步骤进行实验，本实验滴加兔抗受体浓度比例为1∶150，滴加生物素标记的二抗浓度比例为1∶1000，后经过ECL发光，留图，进行半定量分析。

1.4荧光定量qRT-PCR检测受体mRNA表达：超净生物柜中完成，常规提取法提取总RNA进行逆转录。利用primer5.0软件校对设计出PCR特异性引物。

2　结 果

2.1使用ACSF灌流对照组和酒精暴露组子代大鼠延髓脑片标本，测量RRDA的吸气时程、呼吸周期、放电积分幅度，实验结果表明对照组和酒精暴露组在以上各时间点无统计学差异（P＜0.05），60 min内稳定无衰减，说明本实验模型稳定可靠。经单因素方差分析统计检验，酒精暴露组RRDA的TI缩短，RC延长、IA减弱，酒精暴露组RRDA弱于对照组。

2.2酒精暴露组腺苷A2A受体蛋白表达低于对照组：通过Western Blot方法检测腺苷A2A受体蛋白表达的变化，以GAPDH为内参照，把对照组进行标准化。腺苷A2A受体蛋白在实验组中的表达量明显低于对照组，见表1。

表1　Western Blot检测腺苷A2A受体蛋白表达结果（±s，n=3）

表1　Western Blot检测腺苷A2A受体蛋白表达结果（±s，n=3）

组别　腺苷A2A受体　t　P对照组　1.011±0.107　5.022　0.014酒精暴露组　0.637±0.080

2.3酒精暴露组腺苷A2A受体mRNA表达低于对照组：通过qRT-PCR方法检测腺苷A2A受体mRNA表达的变化，以GAPDH为内参照，把对照组进行标准化。结果显示：与对照组相比，酒精暴露组中腺苷A2A受体mRNA表达量明显低于对照组，见表2。

表2　qRT-PCR检测腺苷A2A受体mRNA表达结果（±s，n=3）

表2　qRT-PCR检测腺苷A2A受体mRNA表达结果（±s，n=3）

组别　腺苷A2A受体mRNA　t　P对照组　1.015±0.134　4.262　0.012酒精暴露组　0.642±0.059

3　讨 论

腺苷A2A受体在中枢神经系统内广泛分布，参与多种生理和病理学过程，在脑缺血、炎症、认知记忆等方面的调节较多见，但腺苷A2A受体在孕期酒精暴露抑制子代延髓呼吸中枢功能中的作用尚不多见，为明确腺苷A2A受体在孕期酒精暴露新生大鼠延髓脑片基本节律性呼吸放电抑制中的作用，以便进一步丰富和完善孕期酒精暴露引起子代呼吸抑制的作用机。在本实验中，使用出生2 d的新生大鼠，制备其含面神经后核内侧区的延髓脑片，通过玻璃微吸附电极描记延髓脑片舌下神经根的基本节律性呼吸放电活动，来研究腺苷A2A受体是否对呼吸基本节律性放电起调节作用，为研究孕期酒精暴露对新生大鼠延髓脑片RRDA的影响，采用神经电生理技术分析结果示，与对照组相比，酒精暴露组RRDA的吸气时程缩短、放电积分幅度减弱、呼吸周期延长。经统计学处理分析后，结果提示孕期酒精暴露使子代延髓脑片RRDA兴奋性减弱，而RRDA反应了延髓的呼吸功能，因此孕期酒精暴露抑制了子代延髓呼吸中枢的呼吸功能。而酒精引起中枢神经系统功能失调的机制是多方面的。在神经元突触形成的关键时期，孕期酒精暴露抑制神经元细胞增殖和周期，大大降低细胞的存活率，诱导神经元发生凋亡。孕期酒精暴露诱导神经元凋亡可通过线粒体途径和死亡受体途径，其中主要以死亡受体途径为主。酒精能通过氧化应激作用使活性氧增加、降低细胞抗氧化能力、线粒体发生功能障碍及DNA损伤等引起细胞凋亡，使神经元数量减少，损伤中枢神经系统。由于孕期酒精暴露能下调腺苷A2A受体，使抑制性神经递质腺苷和GABA释放增多，减弱了神经元兴奋性，抑制呼吸神经元，这与我们的实验结果相符。孕期酒精暴露抑制子代呼吸也与腺苷A2A受体表达下调有关。孕期酒精暴露通过降低腺苷A2A受体的转录和翻译、减少腺苷A2A受体数量、降低腺苷A2A受体的活性和功能起到了抑制延髓基本节律性呼吸放电的作用，这可能是孕期酒精暴露抑制子代延髓呼吸功能的机制之一。

［1］ Nam HW，Bruner RC，Choi DS.Adenosine signaling in striatal circuits and alcohol use disorders ［J］.Mol Cells，2013，36（3）:195-202.

［2］ Takahashi RN，Pamplona FA，Prediger RD.Adenosine receptor antagonists for cognitive dysfunction:a review of animal studies［J］. Front Biosci，2008，13:2614-2632.

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1671-8194（2016）22-0037-02