周 波,张翠英,陈叶福,石婷婷,刘小二,肖冬光(天津科技大学 生物工程学院,工业发酵微生物教育部重点实验室,天津市工业微生物重点实验室,天津 300457)
高浓高温对啤酒酵母发酵性能的影响
周波,张翠英,陈叶福,石婷婷,刘小二,肖冬光*
(天津科技大学 生物工程学院,工业发酵微生物教育部重点实验室,天津市工业微生物重点实验室,天津 300457)
以啤酒酵母S-6为实验菌株,研究了主发酵温度和原麦汁浓度对啤酒发酵的残糖、酒精度、风味物质和絮凝性等性能指标的影响。结果表明,原麦汁浓度一定时,主发酵温度对高级醇和乙酸酯的含量影响较大,主发酵温度由10℃提高至16℃时,高级醇含量提高了10%~20%,乙酸酯含量提高了8%~16%,但CO2累积质量损失、残糖、酒精度和絮凝性基本不受温度的影响;主发酵温度一定时,原麦汁浓度对酵母絮凝性影响较大,原麦汁浓度越高,酵母絮凝性越低,将高浓(18°Bx)发酵液稀释50%至常浓(12°Bx),残糖、酒精度和高级醇的含量与常浓发酵液基本相同。该研究为选育高温高浓发酵低产高级醇同时强絮凝性酵母菌株提供了重要依据。
高浓发酵;高温发酵;高级醇;乙酸酯;絮凝性
啤酒高浓酿造技术由美国和加拿大在20世纪70年代率先推出,现在,北美和北欧的一些国家已将高浓酿造稀释法作为通常的生产技术,国内高浓酿造技术的应用也越来越广泛,啤酒行业的竞争也越来越激烈。啤酒高浓酿造是指在啤酒酿造过程中糖化得到较高的麦芽汁浓度(14°P以上),并在发酵后期用饱和的CO2脱氧水稀释成常规浓度啤酒(10~12°P)的技术。高浓酿造的优点是在不增加糖化、发酵等相关生产设备的基础上,能够大大提高企业啤酒的生产能力,减少能源消耗,降低生产成本[1-2]。但是,高浓度的麦芽汁也会给啤酒酿造带来一系列的问题,如发酵不完全,残糖量高,发酵周期延长,泡沫稳定性差,啤酒风味不协调等[3-5]。杨小兰等[6]研究表明,高浓酿造过程中高级醇的生成与接种量、糖浆浓度、α-氨基酸态氮含量有关,18°Bx麦汁发酵的高级醇生成量显著高于12°Bx麦汁发酵的高级醇生成量。RUSSELI等[7-8]认为高浓麦汁与常浓麦汁相比,其增加的酯水平是成比例的,而ANDERSON R等[4]报道与传统的麦汁相比,高浓麦汁发酵产生更多的酯类和高级醇,尤其是乙酸乙酯和乙酸异戊酯,但与原麦汁浓度不成比例。高浓酿造对啤酒酵母的影响也很大,主要表现在细胞形态的变化、细胞活性的降低,发酵性能的降低等。啤酒企业最直接的感受则是酵母使用代数降低、絮凝性变差、酵母自溶等[9]。
在主发酵过程中,温度的控制是至关重要的,主发酵温度低,麦汁浓度下降慢,发酵时间延长;反之,主发酵温度高,麦汁浓度下降快,发酵周期缩短。就下面发酵啤酒酵母而言,低温发酵的温度控制在7.5~9.0℃,高温发酵的温度控制在10~13℃[1,10]。提高主发酵温度,可以加快酵母的繁殖和发酵,这是对缩短发酵周期有利的方面。但是提高温度后,酵母的代谢作用发生变化,将产生多量的酯类、高级醇等挥发性物质,严重影响啤酒的风味[11]。近年来,关于提高啤酒主发酵温度方面的研究不多,肖冬光等[12]以啤酒酵母SC-4为出发菌株,经紫外(ultraviolet,UV)诱变育种后获得一株亮氨酸缺陷型菌株MS-11,此突变株在较高的主发酵温度(14℃)条件下高级醇生成量为65.35 mg/L,与出发菌株在9℃发酵条件下的高级醇生成量63.24 mg/L基本相当。
本研究以啤酒酵母S-6为出发菌株,通过改变啤酒的发酵工艺条件,研究原麦汁浓度和主发酵温度对啤酒酵母发酵性能的影响,为下一步选育适于高浓高温发酵的啤酒酵母提供重要的理论依据。
1.1材料与试剂
1.1.1菌株
下面发酵工业啤酒酵母菌株S-6(Saccharomyces cerevisiae):天津科技大学工业微生物教育部重点实验室保存。
1.1.2培养基
酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(yeast extract peptone dextrose,YEPD):1%酵母提取物,2%葡萄糖,2%蛋白胨,pH6.0,121℃灭菌20 min。
麦芽汁培养基:称量一定量粉碎的麦芽,按1∶4(g∶mL)的料水比糖化至碘检完毕,通过蒸发浓缩的方式制得18°Bx高浓麦汁,再利用糖度计调整外观糖度至12°Bx,制得常浓麦汁,115℃、0.1 MPa灭菌20 min。种子培养基和发酵培养基均使用麦芽汁培养基。
以上培养基各组分配比均为质量体积比(g∶mL),固体培养基需加2%琼脂。
1.2仪器与设备
ZXJD-A1270恒温培养箱:上海智诚分析仪器制造有限公司;25mL附温比重瓶:安徽省凤阳县玻璃厂;50mL具塞比色管:济宁佰一化工有限公司;UV-5200型紫外分光光度计:上海元析仪器有限公司;7890A型气相色谱仪:美国安捷伦科技公司。
1.3方法
1.3.1不同发酵工艺的确定
4种不同的发酵工艺条件,分别为①常浓常温(12°Bx、10℃)、②常浓高温(12°Bx、16℃)、③高浓常温(18°Bx、10℃)、④高浓高温(18°Bx、16℃)。
1.3.2啤酒发酵过程
菌种活化:保存菌种转接至YEPD斜面试管30℃活化培养2 d。
一级种子培养:取斜面菌种一环,接种于装有5 mL麦汁的试管中,28℃静置培养24 h。
二级种子培养:一级种子液按10%的接种量接入盛有50 mL麦汁的150 mL三角瓶内,16℃静置培养36 h。
啤酒发酵:二级种子液经过离心得到酵母泥,酵母泥按0.5%的接种量接入盛有150 mL麦汁的250 mL三角瓶内,静置发酵10~14d。发酵结束后测定CO2累积质量损失、酒精度、残糖、风味物质和酵母絮凝性等啤酒指标和酵母发酵性能。
1.3.3测定方法
CO2质量损失测定:发酵前预先称量发酵体系总质量,发酵过程中每隔12 h称质量一次,称质量前应先摇晃三角瓶,以去除发酵液中的CO2,当质量损失<0.1 g时,表示发酵基本结束。
残糖、酒精度和发酵度的测定:酒精度和发酵度依据啤酒分析方法进行测定[13];利用斐林试剂法测定发酵结束后的残糖[14]。
挥发性风味物质的测定:啤酒发酵液经蒸馏后采用气相色谱法测定[15]。
(1)色谱条件
毛细管色谱柱(19091N-213):30 m×320 μm×0.5 μm;柱温:75℃;进样室温度:200℃;火焰离子检测器温度:230℃;H2:30 mL/min,N2:20 mL/min,空气:400 mL/min;隔吹扫流量:3 mL/min,分流比:20∶1;进样量:1 μL。
(2)试样前处理
发酵结束后,通过蒸馏发酵液得到酒样,取内标液(乙酸正丁酯)0.1 mL,并用上述酒样定容至10 mL,得酒样稀释液。
(3)分析方法
进样需要检测的高级醇和酯类标准样品溶液,测得各物质保留时间。再进酒样稀释液,根据各物质的保留时间初步定性各物质,根据各组分峰面积用内标法定量计算各组分含量。
酵母絮凝性的测定方法:光密度改良法测定酵母絮凝性[16]。
2.1不同发酵工艺条件对发酵速度的影响
图1 不同发酵工艺条件对发酵速度的影响Fig.1 Effects of different fermentation conditions on fermentation rate
按照1.3.2的方法进行发酵,12 h测量一次CO2质量损失,以发酵时间为横坐标,CO2的累积质量损失为纵坐标绘制CO2的累积质量损失曲线,4种发酵工艺对啤酒发酵速度的影响,结果见图1。由图1可知,原麦汁浓度为12°Bx或18°Bx时,高温发酵(16℃)比常温发酵(10℃)的发酵周期都缩短了3 d,说明当原麦汁浓度相同时,主发酵温度对发酵速度影响较大,主发酵温度越高,发酵速度越快,发酵周期越短,但是,同一原麦汁浓度条件下的不同主发酵温度对CO2的累积质量损失基本没有影响。主发酵温度为10℃时,高浓(18°Bx)发酵的CO2的累积质量损失是常浓(12°Bx)发酵的1.43倍;主发酵温度为16℃时,高浓发酵的CO2的累积质量损失是常浓发酵的1.5倍,说明当主发酵温度相同时,18°Bx和12°Bx麦汁发酵后的CO2累积质量损失变化比例符合浓度变化的比例。
2.2不同发酵工艺条件对发酵性能的影响
将啤酒酵母菌株S-6按照4种不同的发酵工艺进行发酵,发酵结束后测定发酵液的残糖、酒精度和发酵度,结果见表1。由表1可知,原麦汁浓度为12°Bx,主发酵温度为10℃时,残糖、酒精度和发酵度分别为(0.60±0.02)g/100mL、(4.54±0.12)%vol和(71.23±0.82)%,原麦汁浓度为12°Bx、主发酵温度为16℃时,残糖、酒精度和发酵度分别为(0.65±0.02)g/100 mL、(4.50±0.05)%vol和(72.48±0.34)%,通过SPSS软件进行显著性分析,当原麦汁浓度相同时,不同主发酵温度条件下测得的残糖、酒精度和发酵度没有显著性差异,说明原麦汁浓度相同时,主发酵温度对残糖、酒精度和发酵度等主要发酵性能没有影响。用高浓麦汁(18 °Bx)发酵时,可以得出上述相同的结论。
比较相同主发酵温度条件下的不同原麦汁浓度发酵后的残糖、酒精度发现,随着原麦汁浓度的提高,残糖和酒精度都有所升高。主发酵温度为10℃时,用12°Bx麦汁发酵的残糖为0.60 g/100 mL,用18°Bx麦汁发酵的残糖为0.95 g/100 mL,较12°Bx麦汁发酵的残糖提高了0.58倍,接近于原麦汁浓度提高的倍数,同样地,18°Bx麦汁发酵的酒精度较12°Bx麦汁发酵的酒精度提高了0.53倍。上述结果表明,18°Bx和12°Bx麦汁发酵后的残糖和酒精度含量变化的倍数基本符合麦汁浓度变化的倍数,即将18°Bx麦汁的发酵液稀释50%后可达到常浓麦汁的酒精度和残糖量。
发酵度反映了酵母对糖类的发酵情况,有些酵母不能或较少地发酵麦芽三糖,表现为低发酵度;有些酵母能发酵麦芽四糖或异麦芽糖,表现为高发酵度[17]。从表1可以看出,不同的发酵条件对啤酒的发酵度影响不大,四种发酵工艺条件下的啤酒发酵度都处于较高的水平。
2.3不同发酵工艺对高级醇和乙酸酯含量的影响
发酵结束后,对发酵液进行蒸馏,获得待测酒样,采用气相色谱法测定酵母菌株S-6在不同发酵工艺条件下发酵液中高级醇和乙酸酯的含量,结果见表2。
表1 不同发酵工艺条件对发酵性能的影响Table 1 Effects of different fermentation conditions on fermentation performance
表2 不同发酵工艺条件高级醇和乙酸酯含量的比较Table 2 Comparison of higher alcohols and acetic esters production under different fermentation conditions mg/L
从表2可以看出,发酵工艺条件的不同对总高级醇和总乙酸酯的影响较大,原麦汁浓度为12°Bx时,16℃发酵产生的总高级醇含量比10℃发酵时提高了14.0%,总乙酸酯的含量提高了16.2%;原麦汁浓度为18°Bx时,16℃发酵产生的总高级醇含量比10℃发酵时提高了13.0%,总乙酸酯的含量提高了8.0%。在相同的原麦汁浓度条件下,经SPSS软件分析,不同主发酵温度生成的总高级醇和总乙酸酯有显著性差异,主发酵温度越高,总高级醇和总乙酸酯的含量越高。当发酵温度相同时,原麦汁浓度越高,发酵液中总高级醇和总乙酸酯的含量越高。但将高浓(18°Bx)发酵液稀释50%达到常浓(12°Bx),此时总高级醇含量与常浓发酵液的总高级醇含量基本相同,说明总高级醇的含量是与原麦汁浓度的提高基本成比例的。但是,总乙酸酯的含量与原麦汁浓度的提高不成比例,高浓度稀释啤酒较同浓度发酵的啤酒含有较多的酯类。
2.4不同发酵工艺条件对酵母絮凝性的影响
发酵结束后,发酵液经过离心、洗涤等步骤获得酵母泥,按照1.3.3方法测定酵母的絮凝性,结果见表3。
表3 不同发酵工艺条件对酵母絮凝性的影响Table 3 Effects of different fermentation conditions on yeast flocculation
酵母絮凝性是啤酒酵母的一个重要特性,絮凝性的强弱不仅对啤酒的发酵周期、过滤性能等生产过程控制具有重要意义,而且会影响到啤酒的风味,在生产上具有特殊的意义,也是区别酵母菌株的一项重要内容[18]。由表3可以看出,不同的发酵工艺条件对酵母絮凝性的影响不同。通过SPSS软件进行显著性分析,主发酵温度相同时,不同原麦汁浓度对酵母絮凝性有显著影响(P<0.05),主发酵温度为10℃时,18°Bx麦汁发酵的酵母絮凝性较12°Bx麦汁发酵的酵母絮凝性降低了10.4%,而主发酵温度为16℃时,18°Bx麦汁发酵的酵母絮凝性较12°Bx麦汁发酵的酵母絮凝性降低了12.5%。但是,同一主发酵温度条件下的不同原麦汁浓度对酵母的絮凝性影响不大。结果表明,主发酵温度对酵母絮凝性的影响没有原麦汁浓度对酵母絮凝性的影响大,原麦汁浓度越高,酵母的絮凝性越低。
本实验研究了原麦汁浓度和主发酵温度对啤酒发酵各项性能指标的影响。研究结果表明,主发酵温度不仅影响啤酒发酵的速度,还影响啤酒中风味物质的含量。主发酵温度由10℃升至16℃,高级醇含量提高了10%~20%,乙酸酯含量提高了8%~16%。而且主发酵温度对CO2的累积质量损失、残糖、酒精度和絮凝性的影响不大;原麦汁浓度越高,酵母的絮凝性越低,但残糖、酒精度和高级醇的含量与原麦汁浓度的提高基本成比例。
高温发酵通过选育低产高级醇的啤酒酵母菌株能够降低啤酒中的高级醇含量,改善啤酒的风味。高浓发酵通过选育强絮凝性的啤酒酵母,在啤酒发酵后期酵母能够及时地沉降到发酵罐的底部,便于过滤[19-20]。综上所述,选育出一株高温高浓发酵低产高级醇同时强絮凝性的酵母菌株,既可以使啤酒的风味保持在合理的阈值范围内,又可以达到节约能耗,降低生产成本的目的。
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Effects of high gravity and high temperature on fermentation performance of beer yeast
ZHOU Bo,ZHANG Cuiying,CHEN Yefu,SHI Tingting,LIU Xiaoer,XIAO Dongguang*
(KeyLab ofIndustrial FermentingMicrobiology,MinistryofEducation,College ofBioengineering,Tianjin UniversityofScience and Technology,Tianjin 300457,China)
Using beer yeast S-6 as experimental strain,the effects of main fermentation temperature and initial wort gravity on alcohol content,flavor substance,flocculability and other fermentation characters by beer yeast S-6 were studied.The results showed that under certain initial wort gravity,the main fermentation temperature had great effects on higher alcohols and acetic esters.When the main fermentation temperature increased from 10℃to 16℃,higher alcohols content increased 10%to 20%,acetic esters increased 8%to 16%,but no effects on total loss of CO2,residual sugar,alcohol content and flocculability.In addition,the initial wort gravity had great effects on flocculability under certain main fermentation temperature;the original wort concentration was higher,while the flocculability of beer yeast was lower.When the high-gravity fermentation broth(18°Bx)was diluted50%totheconventionalgravity(12°Bx),therewasnosignificantdifferencesinresidualsugar,alcoholcontentandhigheralcoholswithcommon fermentation broth.The research provided an important basis for breeding a low-yielding higher alcohols and strong flocculability beer yeast under high temperature and high gravity fermentation process.
high gravity fermentation;high temperature fermentation;higher alcohols;acetic esters;flocculability
Q815;TS261.4;TS262.5
0254-5071(2016)02-0009-04
10.11882/j.issn.0254-5071.2016.02.003
2015-12-02
国家自然科学基金资助项目(31271916)
周波(1988-),男,硕士研究生,研究方向为现代酿造技术。
肖冬光(1956-),男,教授,博士,研究方向为现代酿造技术。