黑曲霉中单宁酶基因的克隆表达及酶学特性分析

李海花，张　蕾，陈龙宾，朱　琪，乔家运，王文杰

（天津市畜牧兽医研究所，天津 300381；天津市畜禽健康养殖技术工程中心，天津300381）

黑曲霉中单宁酶基因的克隆表达及酶学特性分析

李海花，张蕾，陈龙宾，朱琪，乔家运，王文杰

（天津市畜牧兽医研究所，天津 300381；天津市畜禽健康养殖技术工程中心，天津300381）

本试验旨在从一株黑曲霉中克隆单宁酶基因，并研究其酶学性质。利用前期分离的一株黑曲霉菌株SL-5，克隆出单宁酶基因，基因全长1533 bp，编码510个氨基酸；使用大肠杆菌BL21作为宿主，并使用pET32a（+）作为表达载体，实现了单宁酶基因在大肠杆菌中的表达。纯化的单宁酶能够降解单宁，酶的最适反应温度为40℃，最适反应pH为6.0。

单宁；单宁酶；大肠杆菌；克隆；表达

［Abstract］This study was conducted to clone tannase gene from Aspergillus niger and investigate its tannin-degrading characterization.We cloned the tannase gene from Aspergillus niger（SL-5），and the open reading frame of the gene contained 1533 bp coding for a 510 amino-acid matured protein，and expressed the tannase protein（rTannase）in Escherichia coli by using pET32a（+）vector.We found that the purified tannase was able to degrade hydrolysable tannin，exhibiting optimal enzyme activity at 40℃and pH 6.0.

［Key words］tannins；tannase；Escherichia coli；cloning；expression

单宁广泛分布于植物的各部位，如树叶、树皮、树干和种子。根据其结构和特性，通常分为水解单宁和缩合单宁 （Khanbabaee和 van Ree，2001）。饲料中高浓度的单宁会降低反刍动物的生产性能和饲料转化效率，通常使用聚乙二醇和聚乙烯基吡咯烷酮这两种化学物质去除单宁的危害（Ephraim等，2005），但通常处理成本较高。单宁酶 （E.C.3.1.1.20）能切割水解单宁之间的酯键（Battestin和Macedo 2007），某些微生物能分泌单宁 酶（Böer等 ，2009；O'Donovan和 Brooker，2001）。但是，由于单宁酶的产量较低，而且生产条件苛刻，限制了其在饲料中的应用。因此，采用基因工程技术提高单宁酶的产量有重要意义。

本研究使用实验室前期分离到的一株能降解单宁的黑曲霉菌株SL-5（乔家运等，2011），克隆其中含有的单宁酶基因，并实现在大肠杆菌中的表达。

1　材料与方法

1.1菌株、载体和工程菌黑曲霉SL-5菌株为本实验室分离，用于基因组DNA的提取。pET-32a（+）载体购自Novagen公司，用于构建单宁酶大肠杆菌表达载体。E.coli BL21感受态细胞由中国农业大学惠赠，用于单宁酶的表达。

1.2主要试剂基因组DNA提取试剂盒、小量DNA片段快速胶回收试剂盒、小量质粒提取试剂盒、dNTPs（10 mmol/L）和DNA分子量标准，均购自天根生化科技有限公司；高保真Taq DNA聚合酶和DNA快速连接试剂盒均购自Takara公司；限制性内切酶EcoR I和HindⅢ购自NEB公司；Gold-View核酸染料购自赛百盛；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）购自博大泰恒生物技术有限责任公司；蛋白质分子量标准购自Fermentas公司；BCA蛋白定量分析试剂盒购自美国Pierce公司。

1.3引物设计与合成根据GenBank已经发表的单宁酶基因序列 （登录号：XM-001402449.1），用Premier5.0设计引物。上游引物 （Tan-F）：5'-CGGAATTCTGCAATGTCACTGTTACC-3'；下游引物（Tan-R）：5'-CCCAAGCTTGAAAACGGGCATCT TG-3'。上下游引物分别引入EcoR I和HindⅢ酶切位点（下划线）及相应的保护性碱基。PCR产物包含完整的单宁酶基因，同时单宁酶基因与pET-32a（+）载体上的his-tag标签处于同一个ORF中，获得的重组质粒命名为pET32a-Tan。引物由北京奥科生物有限公司合成。

1.4单宁酶基因的克隆与表达

1.4.1单宁酶基因的克隆按照基因组DNA提取试剂盒操作说明提取黑曲霉菌DNA。以提取的DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系（50 μL）：10×PCR Buffer 5 μL，dNTPs（10 mmol/L each）1μL，上游引物和下游引物各2μL（10pmol/L），模板5 μL，高保真Taq DNA聚合酶（5 U/μL）1 μL，补加去离子水至50 μL。反应条件为：94℃预变性4 min；94℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸2 min，共35个循环；72℃终延伸5 min。PCR扩增结束后，取5 μL反应产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳，凝胶成像系统下观察扩增结果。

1.4.2单宁酶基因原核表达载体构建与鉴定将PCR产物特异性片段切下，用小量DNA片段快速胶回收试剂盒回收目的片段。根据操作说明分别用EcoR I和HindⅢ限制性内切酶对回收纯化的PCR产物和pET-32a（+）载体进行双酶切，并对双酶切产物进行切胶回收和纯化。取4 μL双酶切目的片段、1 μL双酶切pET-32a（+）载体和5 μL连接液（Takara公司产品）在16℃下连接反应4 h。将连接产物（pET-32a-Tan）化学转化E.coli BL21感受态细胞，并涂布在含Amp+ （100 μg/mL）的LB平板上，37℃培养12 h，进行抗性筛选。挑取抗性筛选为阳性的单菌落培养后，提取重组质粒pET-32a-TanE，利用双酶切质粒的方法鉴定阳性克隆。将双酶切鉴定为阳性的克隆送往诺赛基因公司测序。利用DNAMAN软件分析Tan基因扩增和原核表达载体构建的正确性。

1.4.3重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达及SDSPAGE分析将测序正确的工程菌株接种于LB液体培养基中 （含100 μg/mL氨苄青霉素），37℃过夜振荡培养。按1%接种于100 mL含Amp的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.5～0.6，菌液经冰浴降温后，加入IPTG至终浓度为0.5 mmol/L，16℃低温诱导培养12 h，收集菌体，同时设只含表达载体pET-32a（+）的E.coli BL21对照。诱导完成后，各取1 mL菌液，分别加入SDS上样缓冲液，悬浮混匀，100℃水浴5 min，12000 r/min离心2 min，取上清经12%SDS-PAGE电泳，考马斯亮兰染色，脱色，分析蛋白表达情况。

1.4.4单宁酶活性分析酶活测定：取4支洁净的10 mL具塞试管，分别设定为对照平行管和测定平行管，在每支试管中先后各加入0.01 mol/L柠檬酸缓冲液和1 mL酶液，40℃下平衡5 min，先将4 mL 99%乙醇加入对照管中，使酶失活。5 min后，在4支试管中加入底物没食子酸丙酯溶液，40℃保温，准确反应10 min，在测定管中加入4 mL 99%乙醇终止反应。从上述4支试管中各取1 mL反应液，分别定容至10 mL，并测定其在270 nm处吸收值（A）。以重蒸水代替底物溶液重复上述操作作为空白。将反应温度为40℃条件下，1 mL酶液每分钟使PG液在270 nm处减少0.001个吸收值定义为1个酶活力单位。

酶蛋白浓度测定：纯化后的单宁酶浓度测定参照BCA蛋白定量分析试剂盒的方法进行。

1.4.5单宁酶特性分析最适反应温度：分别在20、30、40、50、60、70℃时测定单宁酶活性，结果以相对酶活性进行表示。

酶最适反应pH：分别采用pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的柠檬酸缓冲液测定酶活性，结果以相对酶活性进行表示。

2　结果与分析

2.1单宁酶基因的克隆以黑曲霉菌的全基因组为模板，以Tan-F和Tan-R为引物，按照1.4.1中的PCR反应体系和反应条件扩增出大小为1500 bp的特异性条带，与预期大小一致（图1）。

图1　黑曲霉菌单宁酶基因的PCR扩增

2.2重组质粒pET32a-Tan的构建与鉴定将PCR扩增的特异性片段回收纯化后，用EcoR I和HindⅢ酶切并纯化，连接到相同酶切回收后的原核表达载体pET-32a（+）上，获得pET-32a-Tan原核表达载体，转化E.coli BL21。对抗性筛选为阳性的重组质粒用EcoR I和HindⅢ进行双酶切鉴定，经琼脂糖凝胶电泳检测，结果可见载体条带5900 bp和目的条带1500 bp（图2），与预期大小一致。双酶切鉴定为阳性克隆的测序结果，通过DNAMAN软件分析，发现Tan基因无核苷酸突变，Tan基因与载体上的tag-his标签处于同一个ORF中，说明重组质粒pET32a-Tan构建正确。

图2　重组质粒双酶切结果

2.3原核表达产物的检测将鉴定正确的pET32a-Tan转化至大肠杆菌BL21，经IPTG诱导该工程菌12 h后，通过12%SDS-PAGE分析，可见约76 kDa的蛋白条带，这与预期的Tan-his融合蛋白大小相符（利用EXPASY在线预测）。重组蛋白可溶性分析表明，单宁酶重组蛋白是以可溶性形式表达。利用Ni-NTA柱在天然条件下纯化单宁酶重组蛋白，纯化的蛋白液经12%SDSPAGE分析后，有约76 kDa的Tan-his融合蛋白条带，并且纯度较高（图3）。试验结果说明，单宁酶基因在大肠杆菌中得到表达，并且已经成功获得较高纯度的单宁酶重组蛋白。

图3　SDS-PAGE分析单宁酶重组蛋白的表达和纯化

2.4重组单宁酶酶学特性分析由图4和图5可以看出，重组单宁酶的最适反应温度是40℃，最适反应pH值在5.0～6.0。

图4　单宁酶最适反应温度分析

图5　单宁酶最适pH反应分析

3　讨论

单宁广泛存在于各种植物当中，与纤维素、蛋白质、酶、脂肪、核酸和氨基酸等物质形成复合物，可对微生物产生抗性 （O'Donovan和 Brooker，2001）。当饲料干物质中单宁含量超过6%时，会降低动物的饲料采食量、生长速度、体增重和养分利用效率，采食单宁量更高时会造成动物死亡，这是由于在动物的解毒过程中，没有消除单宁或者其降解产物的毒性（Bhat等，1996）。通过分泌脯氨酸含量丰富的唾液蛋白，小鼠能耐受高浓度的单宁（Mehansho等，1987），但对于牛和羊等反刍动物来说，脯氨酸含量丰富的唾液蛋白并不起关键作用（Bhat等，1996），这说明不同动物耐受单宁能力的机制并不相同。

从不同来源的样品中分离到能降解单宁的细菌和真菌（Bo·er等，2009；O'Donovan和Brooker，2001），其中部分微生物能产生胞外单宁酶（Belur等，2010；Kasieczka-Burnecka等，2007）。有研究报道黑曲霉产单宁酶的能力很强，因此，黑曲霉已被应用于多种工业生产中（Gupta等，1997）。

采用基因工程技术生产目标蛋白有很多优点，如培养条件简单、目标蛋白产量和纯度高、价格便宜等。目前已经从不同有机体中克隆了单宁酶的基因，如黑曲霉 CBS（GenBank No.XM-001402449）、米曲霉（GenBank No.D63338）和褶皱裸胞壳NH4（GenBank No.JX104141），不同来源的单宁酶的分子量为186～300 kDa（Hatamoto等，1996）。研究发现，米曲霉所产的单宁酶是由两个分子量分别为30 kDa和33 kDa的亚基通过二硫键交联而成（Hatamoto等，1996）。本研究从黑曲霉克隆到的单宁酶基因（GenBank No.JN848716），通过序列比对，与已经公布的不同来源的单宁酶核酸序列相似性分别为93%（黑曲霉CBS，GenBank No.XM-001402449）、92%（褶皱裸胞壳，GenBank No.JX104141）和76%（米曲霉，GenBankNo.D63338）。酵母表达系统需翻译后修饰，并且表达量高，通常用于生产真核蛋白。研究报道，采用酵母表达系统成功表达重组单宁酶 （Böer等，2011；Zhang等，2004）。本研究中，尝试使用大肠杆菌表达系统生产单宁酶，并实现成功表达。当使用大肠杆菌BL21菌株作用宿主，并使用pET32a（+）作为载体进行外源蛋白表达时，一部分蛋白分泌进入细胞周质中，另一部分形成包涵体。测定酶活性时仅限于纯化的细胞周质中的酶蛋白，因此本研究测定的重组单宁酶活性较低。在下一步研究当中，需要关注是否有其他因素影响单宁酶的活性，如何采用其他表达系统提高酶的产量，以及酶活性和酶蛋白结构之间的关系。

4　小结

本研究从产单宁酶的黑曲霉菌株中克隆出了单宁酶基因，并实现其在大肠杆菌中的表达，纯化的重组单宁酶最适反应温度是40℃，最适反应pH是6.0。

［1］乔家运，李平，陈龙宾，等.单宁降解菌的筛选及降解研究［J］.饲料工业，2011，32（5）：28～29

［2］Battestin V，Macedo G A.Effects of temperature，pH and additives on the activity of tannase produced by Paecilomyces variotii［J］.Electron J Biotechnol，2007，10：191～199.

［3］Belur P D，Gopal M，Nirmala K R，et al.Production of novel cell-associated tannase from newly isolated Serratia ficaria DTC［J］.J Microbiol Biotechnol，2010，20：732～736.

［4］Bhat T K，Makkar H P S，Singh B.Isolation of a tannin-protein complexdegrading fungus from faeces of hill cattle［J］.Lett Appl Microbiol，1996，22：257～258.

［5］Böer E，Bode R，Mock H P，et al.Atan1p-an extracellular tannase from the dimorphic yeast Arxula adeninivorans：molecular cloning of the ATAN1 geneandcharacterizationoftherecombinantenzyme［J］.Yeast，2009，26：323～337.

［6］Böer E，Breuer F.S，Weniger M，et al.Large-scale production of tannase using the yeast Arxula adeninivorans［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2011，92： 105～114.

［7］Ephraim E，Odenyo A，Ashenafi M.Isolation and characterization of tannin-degrading bacteria from faecal samples of some wild ruminants in Ethiopia ［J］.Anim Feed Sci Techno，2005，118：243～253.

［8］Gupta R，Bradoo S，Saxena R K.Rapid purification of extracellular tannase using polyethylene glycol-tannic acid complex［J］.Lett Appl Microbiol，1997，24：253～255.

［9］Hatamoto O，Watarai T，Kikuchi M，et al.Cloning and sequencing of the gene encoding tannase and a structural study of the tannase subunit from Aspergillus oryzae［J］.Gene，1996，175：215～221.

［10］Kasieczka-Burnecka M，Kuc K，Kalinowska H，et al.Purification and characterization of two cold-adapted extracellular tannin acyl hydrolases from an Antarctic strain Verticillium sp.P9［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2007，77：77～89.

［11］Khanbabaee K，van Ree T.Tannins：classification and definition［J］.Nat Prod Rep，2001，18：641～649.

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［14］Zhang X，Peng L，Zheng S，et al.Secretion，purification，and characterization of a recombinant Aspergillus oryzae tannase in Pichia pastoris［J］.Protein Expr Purif，2004，36：165～169.■

S816.3

A

1004-3314（2016）11-0025-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20161107