微小RNA Let-7/Lin28调节环与鼻咽癌血管新生的关系研究

李鹏

（湖北省襄阳市中心医院 耳鼻喉科，湖北 襄阳 441021）

论著

微小RNA Let-7/Lin28调节环与鼻咽癌血管新生的关系研究

李鹏

（湖北省襄阳市中心医院 耳鼻喉科，湖北 襄阳 441021）

目的探讨微小RNA Let-7/Lin28调节环与鼻咽癌促血管生成因子的关系，并研究这一关系的作用机制。方法选取2012年4月-2014年在湖北省襄阳市中心医院耳鼻喉科就诊的鼻咽癌患者54例。另选取同期40例慢性鼻炎患者和32例健康者作为对照组。采用实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测组织中Lin28A、Lin28B及Let-7a miRNA相对表达量，ELISA检测血清中血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维生长因子（bFGF）及内皮抑素（ES）水平，蛋白免疫印迹法（Western blot）检测H-Ras/PTEN/PI3K/Akt通路蛋白表达情况，分析m iRNA Let-7a/Lin28调节环与血管新生因子的关系。结果RT-PCR检测发现鼻咽癌患者Lin28A m iRNA和Lin28B miRNA相对表达量均高于慢性鼻炎组和健康对照组（P＜0.05），而Let-7amiRNA的相对表达量低于上述两组（P＜0.05）；ELISA检测结果发现鼻咽癌患者组VEGF、bGFG、ES表达量均高于慢性鼻炎组和健康对照组（P＜0.05）；Western blot检测发现鼻咽癌患者组病理组织中H-Ras、p-PI3K及p-Akt表达量高于慢性鼻炎患者组和健康对照组（P＜0.05），而p-PTEN表达量低于上述两组（P＜0.05）；相关性分析发现，Lin28A、Lin28B m iRNA与VEGF、bFGF、H-Ras、p-PI3K及p-Akt呈正相关（P＜0.05），Let-7a m iRNA与VEGF、bFGF、H-Ras、p-PI3K及p-Akt呈负相关（P＜0.05）。结论miRNA Lin28/Let-7调节环与血管新生有定的关联性，而这一关联性可能与激活Ras/PI3K/PTEN/Akt通路有关。

Lin28A；Lin28B；Let-7a；促血管生成因子；H-Ras/PTEN/PI3K/Akt

鼻咽癌是我国南方较为常见的一种恶性肿瘤，采用调强放疗为主的综合治疗可以取得较为理想的效果［1］。但是临床发现，鼻咽癌诊断时多处在晚期，且出现淋巴转移。因此早诊断、早治疗是鼻咽癌患者延缓生存期的重要前提保证［2］。miRNA Let-7家族在恶性肿瘤中表达下降，而Lin28A、Lin28B则升高。目前，已有临床报道证实［3］，miRNA Let-7/Lin28与鼻咽癌的发生、发展有一定的关联性，而癌症的发生、发展，尤其是淋巴转移与血管新生有着密切关系。那么鼻咽癌患者miRNA Let-7/Lin28与血管新生是否具有相关性以及这一相关性的作用机制如何值得研究［4］。本研究旨在探讨miRNA Let-7/Lin28与促血管生成因子的关联性，以及这一关系的作用机制，以期揭示miRNA与鼻咽癌淋巴转移的关系，进而为分子的靶向治疗提供一定的实验基础依据。

1　资料与方法

1.1研究对象

选择2012年4月-2014年在湖北省襄阳市中心医院耳鼻喉科就诊的鼻咽癌患者54例。所有患者经病理组织活检证实为鼻咽癌，其中，男性43例，女性11例，年龄33～69岁，平均（47.1±6.9）岁。根据中国鼻咽癌临床分期委员会“2008年鼻咽癌分期诊断标准”将54例患者分为：初诊患者40例，其中Ⅰ期12例，Ⅱ期15例，Ⅲ～Ⅳ期13例；14例出现淋巴转移。另选取72例疑有肿瘤患者，经病理组织活检分为慢性咽炎患者和健康者并作为对照组。慢性咽炎组：40例，其中，男性31例，女性9例，年龄32～68岁，平均（46.5±6.4）岁。健康对照组：32例，其中，男性25例，女性7例，年龄34～70岁，平均（47.3±6.8）岁。所有患者均签订知情同意书，并经医院伦理委员会同意批准执行。

1.2方法

1.2.1病理标本收集所有研究对象在局部麻醉下行内镜辅助鼻咽活检术，取部分所采集病理组织标本以多聚甲醛固定进行病理学检查，其余组织放入已消毒的离心管，置入液氮中，于-80℃冰箱中冷冻保存备用。

1.2.2血清标本采集所有研究对象在入选后均采取空腹肘静脉血3m l并立即分离血清，置于-40℃冰箱冷冻中备用，统一测定。

1.2.3实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测Lin28A、Lin28B及Let-7a m iRNA将冷冻活检的部分鼻咽组织以液氮吹打使细胞破裂，Trizol法抽提细胞中的总RNA，采用紫外分光光度计判定RNA的纯度并以λ260 nm的光吸收值作为定量，逆转录合成cDNA作为PCR模板，设计靶基因Lin28A、Lin28B及Let-7a miRNA以及内参U6snRNA的正反向引物（引物的正反序列见表1），以cDNA模板合成引物，进行PCR反应，琼脂糖电泳进行有效性验证，将有效的 cDNA模板、Lin28A、Lin28B及Let-7a miRNA以及内参U6snRNA进行RT-PCR，严格按照SYBR Green（TOYOBO公司，日本）说明书进行操作，在LightCyclerTM（Roche公司）PCR仪上进行扩增反应，数据分析采用2-△△Ct求得目的基因相对于内参基因的相对表达量。△Ct=Ct目的基因-Ct内参基因。△△Ct表示正常鼻咽组织与鼻咽癌组织中差异程度。

1.2.4血管新生指标检测检测的血管新生指标有血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、碱性成纤维生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）及血管内皮抑素（Endostatin，ES）。采用酶联免疫法（ELISA）进行检测，严格执行说明书操作。

1.2.5蛋白免疫印迹法（Western blot）检测H-Ras/ PTEN/PI3K/Akt通路将冷冻活检的部分鼻咽组织取出，通入液氮研磨使细胞充分破裂，将破碎的组织装入玻璃混匀器中，按照100（1/10 ng加入适量裂解液，含PMSF），冰上孵育30min，然后4℃离心机，以12 000 r/min离心5 min，吸取上清液，置入-80℃冰箱冷冻保存备用。组织总蛋白经考马斯亮蓝进行定量。组织蛋白质样品加入1/4倍量5×SDS上样缓冲液进行混匀，煮沸变性6 min左右，10% SDS-PAGE115V进行电泳，210mA恒流1 h 40min湿转至硝酸纤维膜（NC膜）上。5%脱脂奶粉TBST缓冲液室温封闭 3 h，加抗 H-Ras-21、PTEN、p-PI3K、p-Akt单抗（鼠抗人，1∶500）。TBST洗膜3次，每次10min，然后与结合辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG（1∶5 000）室温孵育1 h，TBS洗膜3次，每次10 min，最后采用发光试剂盒ECL反应，X胶片曝光显影。

1.3统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（）表示，数据用单因素方差分析，Western blot图片用Image J4.2进行扫描灰度值。用pearson相关性分析指标相关性，P＜0.05为差异有统计学意义。

表1　引物序列

2　结果

2.1RT-PCR检测结果

研究结果显示，鼻咽癌患者Lin28A miRNA、Lin28B miRNA相对表达量均高于慢性鼻炎组、健康对照组（P＜0.05），而Let-7a miRNA的相对表达量低于上述两组（P＜0.05），见表2。

2.2血管新生因子测定结果

血清研究结果显示，鼻咽癌患者组VEGF、bGFG、ES表达量均高于慢性鼻炎组、健康对照组（P＜0.05），见表3。

2.3Western blot检测结果

检测结果显示，鼻咽癌患者组病理组织中H-Ras、p-PI3K及p-Akt表达量高于慢性鼻炎患者组、健康对照组（P＜0.05），而p-PTEN表达量低于上述两组（P＜0.05），见表4和附图。

表2　RT-PCR检测Lin28A、Lin28B及Let-7a m iRNA相对量的结果比较 （）

表2　RT-PCR检测Lin28A、Lin28B及Let-7a m iRNA相对量的结果比较 （）

注：1）与健康对照组比较，P＜0.05；2）与慢性鼻炎组比较，P＜0.05

组别Let-7amiRNA健康对照组　32　2.23±0.61　2.21±0.43　1.49±0.31慢性鼻炎组　40　2.75±0.56　3.49±0.691）　1.27±0.291）鼻咽癌组　54　3.64±0.872）　4.58±0.762）　0.83±0.242）F值　10.41　21.36　8.93 P值　0.019　0.000　0.027例数Lin28AmiRNA Lin28BmiRNA

表3　不同组别血管新生因子结果比较 （）

表3　不同组别血管新生因子结果比较 （）

注：1）与健康对照组比较，P＜0.05；2）与慢性鼻炎组比较，P＜0.05

ES/（ng/L）健康对照组　32　25.47±6.13　12.65±2.89　31.69±4.65慢性鼻炎组　40　31.32±9.601）　19.20±3.531）　32.32±6.31鼻咽癌组　54　50.43±10.122）　30.33±4.182）　76.62±6.332）F值　19.47　10.71　8.83 P值　0.000　0.014　0.031组别例数VEGF/（pg/ml）bFGF/（pg/ml）

表4　Western blot检测H-Ras/PTEN/PI3K/Akt通路蛋白灰度值比情况比较 （）

表4　Western blot检测H-Ras/PTEN/PI3K/Akt通路蛋白灰度值比情况比较 （）

注：1）与健康对照组比较，P＜0.05；2）与慢性鼻炎组比较，P＜0.05

组别p-Akt健康对照组 0.345±0.023 0.462±0.017 0.126±0.015　0.107±0.013慢性鼻炎组0.449±0.0311）0.298±0.0211）0.212±0.0201）0.237±0.0191）鼻咽癌组　0.824±0.0442）0.253±0.0242）0.351±0.0272）0.428±0.0262）F值　13.58　18.32　12.36　19.38 P值　0.010　0.009　0.011　0.007 H-Ras p-PTEN p-PI3K

附图　Western b lot检测H-Ras/PTEN/PI3K/Akt通路蛋白表达情况

表5　相关性分析结果

2.4相关性分析

表5相关性分析显示，Lin28A、Lin28B miRNA与VEGF、bFGF、H-Ras、p-PI3K及p-Akt呈正相关（P＜0.05），与p-PTEN呈负相关（P＜0.05）；Let-7a miRNA与VEGF、bFGF、H-Ras、p-PI3K及p-Akt呈负相关（P＜0.05），与p-PTEN呈正相关（P＜0.05）。

3　讨论

鼻咽癌是我国南方较为常见的一种恶性肿瘤，采用调强放疗为主的综合治疗方法是目前非常有效的方式之一，但是该病隐匿性较高、转移倾向较为强烈，大约有75%的患者发现鼻咽癌时在晚期，其局部已发生淋巴结转移，因此尽早诊断是临床治愈该病的关键点［5］。临床研究结果显示［6］，该病与编码区基因有关，其非编码区基因与鼻咽癌的发生发展有一定的联系，特别是一类高度保守的非编码单链小分子RNA，约有50%左右的miRNA定位于肿瘤相关基因区域，染色体出现异常时miRNA的基因拷贝数出现变化，研究证实［7］miRNA参与了肿瘤发生发展的每一个环节。有报道指出miRNA经过长期保存、反复冻融后仍然可以稳定存在，其在肿瘤患者循环中的表达谱相对于正常人具有显著性差异［8］。因此miRNA具有稳定、不易降解、高效、易得等特点，可以作为肿瘤标志物。在多种人类癌症中，Let-7 miRNA家族的表达发生明显的改变，其调控多种癌相关基因表达情况，具有“抑癌基因”的功能［9］。Lin28是广泛表达于恶性肿瘤细胞中的RNA结合蛋白，研究证实其为Let-7生物合成的重要负向调节因子，也有研究证实，Lin28反过来成为Let-7的主要作用靶点，两者构成了调控癌症发生发展的“双向负反馈调节环”［10］。黄孝文等［4］已经有研究证实，鼻咽癌患者组织中存在Lin28表达上调，而Let-7a表达下调。本研究也证实鼻咽癌患者组织中存在Lin28A、Lin28B均出现上调，而Let-7a出现下调，与黄孝文所研究的基本一致。这也说明鼻咽癌患者存在Lin28/Let-7调节环的表达异常。但需要指出的是黄等并未探讨Lin28/Let-7调节环与血管新生的关系以及关联性的作用机制。

恶性肿瘤的主要临床特征表现在癌细胞容易侵袭周围组织以及发生远处转移，而其转移主要是通过新生血管和淋巴管进行转移［11］。新生血管已经被证实为肿瘤细胞的转移通道，其中VEGF和bFGF是促血管新生作用最强且特异性最高的两种因子，具有促进血管内皮细胞增殖、迁移，从而促进新生血管的形成，而新生血管的形成为癌细胞的转移提供通道以及营养支持，进一步促进癌细胞的增殖和扩散［12］。通过本研究显示，鼻咽癌患者血清中VEGF、bFGF的表达量高于慢性鼻炎组、健康对照组。促血管生成与抗血管生成共同构成一个复杂的网络体系。研究显示［13］，ES增高的恶性肿瘤患者出现远处转移增加的现象，其原因是ES的增高间接的反映出血管新生因子的表达量也明显增加，因此本研究也发现，鼻咽癌患者血清中ES含量明显高于慢性鼻炎组、健康对照组。

Lin28/Let-7调节环影响多种基因、蛋白的表达，主要有C-myc基因、Ras基因、高迁移率组蛋白等。有研究发现［14］，H-Ras的过表达与鼻咽癌的发生、发展密切相关。有研究显示，Ras可以通过Raf//MEK/ ERK和PI3K/PTEN/Akt等通路介导肿瘤的发生、发展，而PI3K/PTEN/Akt通路是目前公认的血管新生通路，该通路上的PI3K、Akt蛋白出现磷酸化后将导致VEGF、bFGF等促血管生成因子的高表达［15］。通过Western blot证实鼻咽癌患者组织中H-Ras、p-PI3K及p-Akt表达量高于慢性鼻炎患者组、健康对照组，而p-PTEN表达量低于上述两组，该结果说明鼻咽癌患者PI3K/PTEN/Akt被激活，导致促血管生成因子高表达。通过pearson相关性分析发现，Lin28A、Lin28B miRNA与 VEGF、bFGF、H-Ras、p-PI3K及p-Akt呈正相关，Let-7a miRNA与VEGF、bFGF、HRas、p-PI3K及p-Akt呈负相关，该结果说明Lin28/ Let-7对鼻咽癌患者PI3K/PTEN/Akt及其下游的促血管生成因子有一定的影响。通过本研究显示，Lin28/Let-7与促血管生成因子具有一定的关联性，而该关联性可能是由于PI3K/PTEN/Akt通路被激活所致。

综上所述，miRNA Lin28/Let-7调节环与血管新生有定的关联性，而该关联性可能与激活PI3K/ PTEN/Akt通路有关。

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（张蕾编辑）

Relationship between m iRNA Let-7/Lin28 feedback loop and nasopharyngeal angiogenesis

Peng Li
（Department of ENT，Xiangyang Central Hospital，Xiangyang，Hubei 441021，China）

Objective To investigate the relationship betweenm iRNA Let-7/Lin28 feedback loop and nasopharyngeal pro-angiogenesis factors，and to study themechanism of its effect.Methods From April 2012 to 2014，54 cases of nasopharyngeal carcinoma（NPC）therapied in ENT in Xiangyang Central Hospital were selected，and 40 cases of chronic rhinitis patients and 32 healthy subjects were selected as control groups.Expressions of Lin28A，Lin28B and Let-7amiRNA relative were detected by RT-PCR，and the levels of VEGF，bFGF and ES in serum were detected by ELISA.Expressions of protein in H-Ras/PTEN/PI3K/Akt pathway were detected by western blotting，and relationship between miRNA Let-7a/Lin28 feedback loop and angiogenesis factors was analyzed.Results Expression levels of Lin28A miRNA，Lin28B miRNA in NPC patients were relatively higher than the other two groups，and the relative expression of Let-7a miRNA was less than the other two groups（P＜0.05）.ELISA test found that expressions of VEGF，bGFG，ES in NPC patients were higher than the control groups（P＜0.05）.Expressions of H-Ras，p-PI3K and p-Akt in NPC patients pathology tissue were higher than the other two groups（P＜0.05），and expression of p-PTEN was less than the above two groups（P＜0.05）.The correlation analysis showed thatLin28A，Lin28BmiRNA were positively correlated with VEGF，bFGF，H-Ras，p-PI3K and p-Akt（P＜0.05），and Let-7am iRNA was negatively correlated with VEGF，bFGF，H-Ras，p-PI3K and p-Akt（P＜0.05）.Conclusions miRNA Lin28/Let-7 feedback loop has certain correlation with angiogenesis，and this associationmay related to the activation of Ras/PI3K/PTEN/Akt pathway.

Lin28A；Lin28B；Let-7a；angiogenic factor；H-Ras/PTEN/PI3K/Akt

R 739.6

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.12.010

1005-8982（2016）12-0044-05

2015-11-17