生殖支原体16SrRNA基因和MgPa基因TaqMan荧光聚合酶链反应检测的比较研究*

唐正宇，王碧玉，蔡亮，谢良伊，姚玲，王太林

（1.长沙卫生职业学院，湖南 长沙 410100；2.湖南省疾病预防控制中心；3.湖南省人民医院，湖南 长沙 410005）

论著

生殖支原体16SrRNA基因和MgPa基因TaqMan荧光聚合酶链反应检测的比较研究*

唐正宇1，王碧玉1，蔡亮2，谢良伊3，姚玲1，王太林1

（1.长沙卫生职业学院，湖南 长沙 410100；2.湖南省疾病预防控制中心；3.湖南省人民医院，湖南 长沙 410005）

目的对生殖支原体（Mg）16SrRNA基因和MgPa基因TaqMan荧光聚合酶链反应（PCR）检测结果进行比较，选取敏感度更高的靶基因进行TaqMan荧光PCR检测。方法选取Mg 16SrRNA基因和MgPa基因为靶基因，根据已报道文献设计合成特异性扩增引物和探针，对泌尿生殖道拭子标本进行TaqMan荧光PCR检测，对Mg不同靶基因TaqMan荧光PCR检测结果进行统计学分析。结果Mg 16SrRNA基因TaqMan荧光PCR检测敏感性为90%，MgPa基因TaqMan荧光PCR检测敏感性为97.5%。结论MgPa基因TaqMan荧光PCR敏感性要高于16SrRNA基因TaqMan荧光PCR。

生殖支原体；16SrRNA基因；M gPa基因；TaqM an荧光聚合酶链反应

生殖支原体（mycoplasma genitalium，Mg）是支原体的一种，由TULLY等于1981年从男性非淋菌性尿道炎（nongonococcal urethritis，NGU）患者尿道分泌物中分离出来，是迄今为止发现的能够自我复制的最小原核细胞型微生物［1］。在男性NGU中的感染率可达21%～45%［2-4］，2009年欧洲NGU治疗指南已明确Mg是NGU病原体之一［2］。目前Mg难以培养，临床标本分离率低，血清学试验与其他支原体存在较强的交叉反应，在实际检测中存在很大局限性。常规聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）对临床标本中Mg的检测缺乏定量评估，针对MgPa和16SrRNA两个靶基因实时荧光定量PCR技术在Mg检测方面得到一定的应用，但国内外没有对这两种基因TaqMan荧光PCR检测结果对比的文献报道，难以选择优势基因用于TaqMan荧光PCR检测，本研究对同一批临床标本根据已报道的文献针对16SrRNA基因和MgPa基因设计引物和探针进行Mg的核酸检测，对两种检测结果进行比较研究，选取敏感度更高的靶基因作为TaqMan荧光PCR检测方法，用于临床上Mg感染者基因快速、准确的诊断。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1Mg标准菌株来源Mg G-37标准株由南华大学病原生物学研究所惠赠。

1.1.2标本来源中南大学湘雅医院皮肤性病就诊患者、湖南省人民医院检验科泌尿生殖道拭子标本246例。患者同时行淋球菌、解脲脲原体、衣原体性病常规检查均为阴性。经常规Mg 16SrRNA基因PCR检测为阳性40例，并经核酸测序证实；阴性标本206例。

1.1.3主要试剂及仪器Qiamp DNA mini kit（德国QIAGEN公司），Hot Star DNA taq酶、dNTP mixture、Platinum Taq DNA polymerase（美国Invitrogen公司），PCR nucleotide mix、Nuclease-free water（美国Promega公司），PCR产物纯化试剂盒（美国Omega公司）。实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司7300型）。

1.2方法

1.2.1引物探针设计根据JESEN［5］等文献设计引物、探针。引物和探针委托Invitrogen生物工程公司合成。见表1、2。

1.2.2Mg DNA的提取拭子标本及标准菌液的DNA提取使用德国QIAGEN公司的Qiamp DNAmini kit试剂盒，具体操作参照试剂盒说明书进行，置入-20℃冰箱冷冻保存备用。

表1　TaqMan荧光PCR中针对MgPa基因的引物及探针

表2　TaqMan荧光PCR中针对16SrRNA基因的引物及探针

1.2.3MgPa基因TaqMan荧光PCR总反应体系25μl，在反应管内依次加入：1×PCR反应液，3.5 mmol/L氯化镁 MgCl2，200 mmol/L dNTP，0.625 U DNAtaq酶，1.0 mmol/L正向引物MgPa-335 F，1.0 mmol/L反向引物MgPa-432R，0.1mmol/L探针Mg-Pa-380，5μl DNA模板，ABI 7300型实时荧光定量PCR反应条件：50℃、1min，95℃、10min，1个循环，95℃变性15 s，60℃退火1min，共50个循环。每个反应板设立标准菌株阳性对照和阴性对照组。

1.2.4Mg 16SrRNA基因TaqMan荧光PCR总反应体系50μl，在反应管内依次加入：1×PCR反应液，5 mmol/L氯化镁 MgCl2，200 mmol/L dNTP，1.25U DNA taq酶2.0mmol/L正向引物My-ins，2.0 mmol/L反 向引物 MGSO-2，0.1mmol/L探针Mgen-P1，4μl DNA模板。ABI7300型实时荧光定量PCR反应条件：50℃、2min，95℃、10min，1个循环，95℃变性15 s，66℃退火1min，共60个循环。每个反应包括阳性对照和阴性对照组。

2　结果

2.1MgPa基因TaqMan荧光PCR检测结果

对246例泌尿生殖道拭子标本进行检测，MgPa基因TaqMan荧光PCR扩增阳性为45例，与常规16SrRNA基因PCR检测结果比较阳性符合率为97.5%（39/40），阴性符合率为97.1%（200/206），总符合率为97.2%（239/246）。

2.2Mg 16SrRNA基因TaqMan荧光PCR检测结果

对同一批246例临床标本检测，Mg 16SrRNA基因TaqMan荧光PCR扩增阳性为38例，与常规16SrRNA基因PCR检测结果比较阳性符合率为90.0%（36/40），阴性符合率为99.0%（204/206），总符合率为97.6%（240/246）。

从检测结果中笔者发现，3种PCR中都为阳性的有36例标本。有3例标本为常规16SrRNA基因PCR和MgPa基因TaqMan荧光PCR检测都为阳性的。仅MgPa基因TaqMan荧光PCR检测和Mg 16SrRNA基因TaqMan荧光PCR检测为阳性的有2例。但有4份标本仅是MgPa基因TaqMan荧光PCR检测为阳性的，经再次检测后仍为阳性。通过检测结果比较，MgPa基因TaqMan荧光PCR敏感性（97.5%）要高于16SrRNA基因TaqMan荧光PCR（90%）。见附图。

附图　Mg 16SrRNA基因和MgPa基因TaqMan荧光PCR检测结果比较

3　讨论

YOSHIDA等［6］于2002年发表第一个实时PCR检测Mg的报道。EDBERG［7］和JURSTRAND［8］等报告显示，与传统的16SrRNA基因PCR比较，实时的16SrRNA基因的PCR的敏感性较低。JURSTRAND等［8］文献里指出男性泌尿生殖道标本Mg实时PCR检测与常规PCR比较，敏感性为72.2%，特异性为99.7%。

在本研究中对Mg 16SrRNA基因和MgPa基因TaqMan荧光PCR检测结果进行比较。根据最新文献检测报道，采集泌尿生殖道拭子标本要优于首段尿标本，其敏感度更显著，故本研究中采集的标本为泌尿道拭子。对246例临床标本进行MgPa基因和16SrRNA基因的Taqman荧光PCR检测结果的比较发现，MgPa基因TaqMan荧光PCR敏感性要高于16SrRNA基因TaqMan荧光PCR，MgPa基因Taq-Man荧光PCR证实是最敏感的方法。在笔者的比较研究中，实时16SrRNA基因PCR在试验中需要4μl DNA模板，而实时MgPa基因的PCR在试验中需要5μl DNA模板，这可能与16SrRNA作为实时PCR检测的靶基因敏感性较低有关。MgPa基因作为实时PCR的靶基因更适合临床Mg的诊断，能为今后开展人群中Mg的感染调查、定量分析Mg感染量与临床表现的关系及开展耐药监测提供依据。

［1］DORMAN C J.Regulation of transcription by DNA supercoiling in Mycoplasma genitalium；global control in the smallest known self-replicating genome［J］.Mol Microbiol，2011，81（2）:302-304.

［2］SHAHMANESH M，MOI H，LASSAU F，et al.2009 European guideline on the of male non-gonococcal urethritis［J］.Int J STD AIDS，2009，20（7）:458-464.

［3］MOI H，REINTON N，MOGHADDARA A.Mycoplasma genitalium is associated with symptomatic and asymptomatic non-gono coccal urethritis in men［J］.Sex Transm Infect，2009，85（1）:15-18.

［4］COX C，MCKENNA J P，WATT A P，et al.Ureaplasma parvum and mycoplasma genitalium are found to be significantly associated with microscopy-confirmed urethritis in a routine genitourinary medicine setting［J］.Int JSTD AIDS，2015，16:DOI: 10.1177/0956462415597620.

［5］JENSEN J S，BJÖRNELIUS E，DOHN B，et al.Use of TaqMan 5'nuclease real-time PCR for quantitative detection of Mycoplasma genitalium DNA in males with and without urethritis who were attendees at a sexually transmitted disease clinic［J］.J Clin Microbiol，2004，42:683-692.

［6］YOSHIDA T，DEGUCHI T，ITO M，et al.Quantitative detection of mycop lasma genitalium from first-pass urine of men with urethritis and asymptomaticmen by real-time PCR［J］.J Clin Microbiol，2002，40（4）:1451-1455.

［7］EDBERG A，JURSTRAND M，JOHANSSON E，et al.comparative study of three different PCR assays for detection of mycoplasma genitalium in urogenital specimens from men and women［J］.J Med Microbiol，2008，57（3）:304-309.

［8］JURSTRAND M，JENSEN JS，FREDLUND H，et al.Detection of mycoplasma genitalium in urogenital specimens by real-time PCR and by conventional PCR assay［J］.Journal of Medical Microbiology，2005，54:23-29.

（张蕾编辑）

Com parative study of TaqM an fluorescence PCR assay detection of m ycop lasma genitalium by 16SrRNA gene and M gPa gene*

Zheng-yu Tang1，Bi-yu Wang1，Liang Cai2，Liang-yi Xie3，Ling Yao1，Tai-lin Wang1
（1.Changsha Health Vocational College，Changsha，Hunan 410100，China；2.Hunan provincial Center for Disease Control and Prevention，Changsha，Hunan 410005，China；3.Hunan People's Hospital，Changsha，Hunan 410005，China）

Objective To compare the TaqMan fluorescence PCR detection results betweenmycoplasma genitalium 16SrRNA gene and MgPa gene.Methods Mycoplasma genitalium 16SrRNA gene and MgPa gene were selected as target genes.According to the reported literatures，the specific amp lified primers and probes were designed and synthesized.Urinary tract swab specimens were detected by TaqMan fluorescent PCR.The results of TaqMan fluorescence PCR detection of different target genes of Mycop lasma genitalium were statistically analyzed.Results The detection sensitivity of 16SrRNA gene and MgPa gene ofmycoplasma genitalium TaqMan PCR was 90%and 97.5%，respectively.Conclusions The sensitivity of TaqMan PCR in the genitalmycoplasma MgPa gene is higher than that of the 16SrRNA gene.

mycoplasma genitalium；16SrRNA gene；MgPa gene；TaqMan fluorescence PCR

R 446.5；R 375；

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.12.009

1005-8982（2016）12-0041-03

2016-02-17

湖南省教育厅科研基金项目（No：14C0090）