八眉猪SLA-DQA基因外显子2多态性分析

寸海霞，谢德琼，王　龙，魏　涛，张　稳，郭鹏辉，刘丽霞（.西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州730030 .西北民族大学土木工程学院，甘肃兰州730030）

八眉猪SLA-DQA基因外显子2多态性分析

寸海霞1，谢德琼1，王龙2，魏涛1，张稳1，郭鹏辉1，刘丽霞1
（1.西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州730030 2.西北民族大学土木工程学院，甘肃兰州730030）

本研究以八眉猪为研究对象，采用PCR-SSCP和克隆测序的方法研究了SLA-DQA基因外显子2功能区的分子遗传特征。结果显示，八眉猪SLA-DQA基因外显子2共有7种等位基因（A、B、C、D、E、F、G）和7种基因型（分别是AA、AB、AC、AE、AF、BB、DG），其中A等位基因和AA基因型占优势，DG基因型为劣势基因型。对不同等位基因进行克隆测序，结果共发现15个氨基酸发生了改变，19个抗原结合位点上共有5个氨基酸发生改变。x2检验结果表明，该基因偏离了H ardy-W ei nberg平衡（P＜0.01）。遗传多态性分析结果表明，八眉猪SLA-DQA基因外显子2，属于中度多态（0.25＜PIC＜0.5）。研究结果表明，八眉猪SLA-DQA基因第2外显子属于多态基因。

八眉猪；SLA-DQA；基因PCR-SSCP；多态性

主要组织相容性复合体（M aj or hi st ocom pat i bi l i t y com pl ex，M H C）分布于白细胞表面，又称白细胞抗原。是一个紧密连锁、高度多态性基因所组成的染色体上的遗传区域，分为Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ类分子。Ⅰ类和Ⅱ类与抗原提呈相关，其分别提呈内源性和外源性抗原肽，Ⅲ类则与免疫因子相关，即M H C不仅参与机体对内外源性抗原识别、结合，与机体获得性免疫应答相关，还控制着机体抑制排斥反应。不同物种的M H C不同，M H C名称分别为H-2（鼠）、SLA（猪）、BOLA（牛）、ELA（马）、OLAP（绵羊）、CLA（山羊）、DLA（犬）和B（鸡）。SLA位于第七号染色体的短臂上，其结构与人的M H C非常相似［1］。SLAⅠ类和Ⅱ类基因具有高度多态性，其中SLAⅡ类分子是一种跨膜蛋白，由α和β链结合而成，在α链上为α1和α2，β链上为β1和β2与免疫球蛋白的结构域相似，α1和β1，特别是β1具有较高的可变性，故而呈现高度多态，有利于适应不同的外来抗原，DQA基因就位于β1上。据报道，最早发现的SLA-DQA为单拷贝基因，序列约为5.5kb，编码255个氨各种动物基酸，包含4个外显子和3个内含子［2］。相关学者采用酶切或PCR-RFLP的方法探讨了合作猪、东北民猪和五指山猪完整的外显子2的多态［3-5］。八眉猪又称大耳猪，具有种质资源独特，中心产区为陕西径河流域、甘肃陇东、宁夏固原和青海互助地区，在高原环境下经过长期自然和人工选择而形成的地方猪种，具有适应性强、性早熟、抗逆性好、产仔多、母性好、沉积脂肪能力强、肉质好、能适应贫瘠多变的饲养管理条件、遗传性状稳定、对近交有抗力等特性［6-7］。本实验采用PCR-SSCP和测序方法对八眉猪DQA基因外显子2进行遗传多态性分析，以期为今后八眉猪的抗病育种提供基础与依据。

1　材料与方法

1.1材料选取222头八眉猪哺乳期仔猪为采样对象，于仔猪出生后一周内采集耳组织并置于75%乙醇中，带回实验室保存于-20℃冰箱中备用。

1.2方法

1.2.1基因组DNA提取采用酚/氯仿提取法［8］，从耳组织中提取DNA并溶解于TE缓冲液，在1%琼脂糖凝胶，经200V电泳检测后，置于-20℃冰箱保存备用。

1.2.2引物设计及 PCR扩增根据GenBank报道AY303988序列的3898-4146bp段，采用Pri m er5.0引物设计软件设计第2外显子的核苷酸序列，引物上游引物：5'-：AGTCAAGTTCTCTTGTCACT-3'，下游引物5'-TGTGAACGGGTAGATTCTGT-3'），扩增目的片段约为378bp，引物由大连宝生物科技股份有限公司合成。

PCR扩增采用25μL的体系，各成分用量 ：10× Buf f er2.5μl，上下游引物各0.5μL，模板DNA 1.0μL，灭菌dd H 2O 19μL，Taq酶0.5μL。

PCR反应条件：94℃预变性2 m i n；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环；最后72℃延伸10 m i n。

1.2.3PCR产物的SSCP检测取2 μL PCR产物，加6 μL DNA变性缓冲液（98%去离子甲酰胺、二甲苯青、溴酚蓝、混合而成）98℃变性10 m i n，然后放置于冰上冰浴10 m i n，在12%聚丙烯酰胺凝胶（Acr：Bi s=39：1），4℃、250 V，30m i n，200V 22h，结束后用银染法显色。

1.2.4克隆用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收不同基因型个体的PCR产物，回收后用PM D19-T Vect or载体连接，并转入大肠杆菌（E.col i）DH 5α菌株；筛选阳性克隆培养，培养后进行菌液PCR扩增；以原始PCR产物为标准物，菌液PCR产物与标准物同时进行SSCP检测。

1.2.5测序将菌液PCR产物后送至工生物工程（上海）股份有限公司和北京奥维森基因科技有限公司进行SANGER法常规测序。

1.2.6数据统计分析利用Popgene 32软件计算基因和基因型频率、遗传杂合度、有效等位基因数，并进行群体的H ardy-W ei nberg平衡检测［9］。根据Bot st ei n等（1980）的方法计算八眉猪的多态信息含量［10］。利用M EGA 6.01软件进行DNA序列比对分析，确定等位基因碱的突变位置［11］。参照SLA命名委员会的命名标准对所得等位基因和单倍型进行命名［12，13］。

2　结果

2.1PCR扩增结选取条带清晰明亮，无杂带，无拖尾的DNA样品进行PCR扩增，用1%琼脂糖凝胶电泳检测。目的条带清晰，无杂带，特异性良好。片段大小与预期大小相符，为378bp，包含完整的第2外显子，部分第1内含子和部分第2内含子（如图1示）。

2.2八眉猪SLA-DQA基因PCR-SSCP检测结果八眉猪SLA-DQA基因第2外显子引物扩增区域检测到7种等位基因，分别标记为A、B、C、G、D、E、F，形成7种基因型，分别为AA、AB、AC、DG、AE、AF、BB（如图2示）。

2.3八眉猪SLA-DQA基因外显子2核苷酸对比分析V八眉猪DQA外显子2中共有13个碱基发生转换，11个碱基发生颠换，导致15个位点发生错义突变，9个位点发生同义突变.（如图3所示）。

2.4八眉猪SLA-DQA基因外显子2氨基酸对比分析共有15个氨基酸发生了突变，其中19个抗原结合位点上共有5个氨基酸发生改变（如图4所示）。

2.5八眉猪SLA-DQA基因外显子2基因型和等位基因频率分布八眉猪以纯合子AA型居多（0.6036），杂合子AF次之（0.1396），GH型最少（0.0225），A基因是八眉猪的优势基因（0.7625），G与H基因为劣势基因（0.113），如表1所示。

八眉猪DQA第2外显子的PIC值为0.3763，属于中度多态（0.25＜PIC＜0.5），期望杂合度为0.3992，高于观测杂合度（0.3423），并且该基因位点偏离了H ardy-W ei nberg平衡状态（p＜0.01）。

3　讨论

M H C是一类分布于白细胞表面，表达于动物核细胞表面的一类紧密连锁并具有高度多态性的基因位点所组成的染色体上的一个遗传区域，其很大程度上决定了动物识别自己、排除非己以维持机体上正常的生理和抵抗疾病的能力［14］，在大猩猩与黑猩猩的研究中表现M H C是现有物种形成前就存在的原始基因［15］，同时表现出高度多态性。目前诸多报道表明了SLA-DQA基因外显子2的多态性，张冬杰［16］采用PCR-RPLP技术对黑龙江野猪与东北黑猪杂交的F1个体进行分析，发现DQA基因的第2、 3、4外显子都具有多态性并且与仔猪的体重相关；蒋岸岸等［17］在藏猪中检测到3种基因型，而在本实验中检测到7种基因型差异性较大，与李华等［18］分别在滇南小耳猪和巴马小型猪DQA外显子2中发现9种和7种PCR-RFLP组合型基因，并表现出中度多态相近。刘榜等［19］对SLA-DQA外显子2的核苷酸序列分析表明该区域具有高度多态性，同时蒋岸岸等［20］用单一的酶切获得藏猪的多态性位点。本研究检测到八眉猪SLA-DQA外显子2检测到的7种基因型中纯合子AA型居多，杂合子GH最少，这与李华等（2006）报道的甘孜藏猪DQA外显子2以纯合子M M型居多符合，与张建明［21］西藏小型猪DQA基因外显子2以杂合子M N居多存在差异。八眉猪在外显子2上纯合子比例高，说明基本达较高纯度，这可能与它所处的地理位置比较偏僻，受外来血缘的影响较小以及长期封闭选育有关。

图1　SLA-DQA基因外显子2PCR产物电泳图

图2　PCR-SSCP检测结果图

多态信息含量（PIC）、遗传杂合度（H e）与纯合度（H o）是评价种猪遗传变异的重要指标。对某一群体，PIC和H e的数值越大，该群体内基因一致性越差，基因的变异性越大，反之，基因的变异性越小，选择潜力也就越小［22］。本研究发现，八眉猪中为度多态（0.25＜PIC＜0.5），并偏离了H ardy-W ei nberg平衡状态（p＜0.01）这可能是由于长期进化中等位基因的积累和融合所致［23］，造成遗传性之间的差异。

图3　SLA-DQA基因第2外显子等位基因序列比对

图4　八眉猪SLA-DQA基因第2外显子氨基酸序列比对

表1　八眉猪SLA-DQA基因外显子2基因型和基因频率

核苷酸的替换是形成M H C基因高度多态的原因。等位基因的多态性也表现在基于点突变的基因序列差异上［24］，本研究经克隆测序后发现13个碱基发生转换，11个碱基发生颠换其中15个位点发生错义突变，9个位点发生同义突变致15个氨基酸发生改变与张冬杰等［25］在东北民猪中发现DQA外显子2是整个基因的高突变区相符同时刘榜等［26］在SLA-DQA外显子2基因新位点研究中发现4个新突变位点和2个新等位基因，为进一步的抗病育种奠定了基础。

4　结论

SLA-DQA基因外显子2在八眉猪中属于中度多态，并偏离了H ardy-W enberg平衡状态，同时还检测出核苷酸的变化导致氨基酸发生突变，为进一步的抗病育种提供依据。

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S858．28文献标识码：B

1003-8655（2016）03-0010-04

2016-03-28

西北民族大学2015年国家级大学生创新创业训练计划项目（201510742083），西北民族大学中央高校基本科研业务费专项资金资助项目（31920130047）

寸海霞（1992-），女，云南丽江人，在读本科生，主要从事分子生物学方面的研究

刘丽霞（1983-），女，甘肃陇南人，博士，高级实验师，主要从事动物遗传育种研究