昆明动物园火烈鸟粪便细菌的分离、培养及鉴定

叶妍琳，杨子江，杨　涛，张斌恺，付　偲，肖　啸、2★（.云南农业大学动物科学学院，云南昆明 65020；2.云南农业大学动物医院，云南昆明65003）

昆明动物园火烈鸟粪便细菌的分离、培养及鉴定

叶妍琳1，杨子江1，杨涛1，张斌恺1，付偲1，肖啸1、2★
（1.云南农业大学动物科学学院，云南昆明 650201；2.云南农业大学动物医院，云南昆明650031）

昆明动物园火烈鸟出现腹泻、急性死亡的情况，通过研究火烈鸟肠道微生物菌群，对肠道微生态健康及其调控作用进行评价，从而了解火烈鸟粪便中的细菌种属，此举可有效防治火烈鸟的肠道疾病，加强对火烈鸟的保护，此次从昆明动物园火烈鸟馆取样火烈鸟粪腹泻便，经过细菌分离培养，染色镜检、生化试验等，结果表明该粪便中分离得到细菌为屎肠球菌、藤黄微球菌、无乳链球菌；动物回归试验表明屎肠球菌、藤黄微球菌具有致病性。

火烈鸟；分离鉴定；屎肠球菌；藤黄微球菌；无乳链球菌

1　引言

随着人们保护鸟类意识的增强，鸟与人类的亲密度增加，鸟类携带病原对人体健康危害的潜在风险逐渐增大，了解鸟类携带的细菌病毒，对有效控制鸟类疾病的发生与流行、防范鸟类疾病传染给人具有指导作用。火烈鸟，又名红鹳、红鹤。为一种大型水鸟，主要分布于非洲、中南美洲，以及印度等部分亚热带地区［1］。

在2014年昆明动物园引进了20只世界濒临灭绝的珍贵火烈鸟，属于外来物种的火烈鸟，为了能够更明确的了解火烈鸟的习性，其自身肠道所带的细菌，是否影响当地的物种，是否有利于火烈鸟在昆明的生长繁殖，作为观赏鸟类的火烈鸟，与人类密切接触的鸟类，有必要对其体内所带细菌进行研究，确保其对人体健康无任何危害。动物消化道是微生物赖以生存的理想场所，其内定植生存的正常微生物菌群与其宿主在进化过程中形成复杂而又稳定的动态平衡的微生态区系［2］。分离和鉴定火烈鸟粪便细菌，能够提供一定程度的健康及致病指标，为下一步火烈鸟疾病防控奠定基础。

屎肠球菌（Ent erococcusFaeci um）属肠球菌属，是人及动物肠道中正常菌群的一部分，肠球菌为圆形或椭圆形、呈链状排列的革兰阳性球菌，无芽胞，无鞭毛，为需氧或兼性厌氧菌［3］。用屎肠球菌JT1701与人体肠系有害菌（大肠杆菌、产气荚膜梭菌、脆弱拟杆菌）和人体肠系益生菌（婴儿双歧杆菌、嗜酸乳杆菌）分别及共同培养发现，肠球球菌对这些菌均有抑制作用。肠球菌感染是新生儿败血症的第3位病因，近几年新生儿和儿童肠球菌败血症的发病率增加了6倍。据报道肠球菌是内源性和外源性医院感染的第二大病原菌，检出率仅次于大肠杆菌。有资料统计，在引起尿路感染的致病菌中，肠球菌感染居第2位；腹腔、盆腔感染，肠球菌居第3位；败血症，肠球菌居第3位，病死率12.6%～57%［4］。

藤黄微球菌（M i crococcusl ut eus），为细菌微球菌科，微球菌属，一般八个菌体聚在一起，似“叠罗汉”，亦称为藤黄八叠球菌，也可单个、成双、四联排列或呈立体包裹状不规则。菌落直径一般为1.0～1.5微米，呈金黄色。在所有培养基上均呈堆团排列。在肉汤琼脂平板上的菌落呈黄色，粗糙粒状，圆形，突起，湿润，闪光，全缘。在血琼脂平板上菌落小于葡萄球菌，呈圆形、凸起、光滑、不透明、黄色菌落。在营养琼脂平板上菌落呈黄色。菌体比葡萄糖大。藤黄微球菌分布于空气、土壤、水以及动植物体表，一般不致病，但可为条件致病菌，引起伤口等局部组织感染，也能引起严重感染，如心内膜炎等疾病。可作抗生素测试菌［5］。

无乳链球菌（S.agal act i ae）也称B族链球菌是乳腺炎的病原体，常存在于乳牛的皮肤、乳头及乳房内，通过挤乳人员的手或挤乳机械以及蝇类的机械携带而传播。这种链球菌引起乳房炎后不产生明显免疫力，目前尚无可靠的多价菌苗［6］。

本试验通过对昆明动物园现有的火烈鸟的粪便进行取样观察，通过试验分离与鉴定，初步了解火烈鸟整个消化道微生物菌群的结构，以及其与火烈鸟自身的健康关系。通过对粪便的细菌的鉴定，不但了解微生物菌群在动物体内的分布结构［7］，为火烈鸟能够健康生长提供了基础的知识，而且利用研究成果更好的隔离危害人类健康的病原。

2　材料与方法

2.1样品来源本试验所使用病料为云南昆明动物园送检样品（1份）；样品包含火烈鸟的火烈鸟肠管、粪便。

2.2试验培养基普通肉汤培养基、血清普通琼脂培养基、LB培养基均购于杭州天和微生物试剂有限公司。

2.3试剂蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、琼脂、乳糖均购于杭州天和微生物试剂有限公司，双蒸水。

2.4主要仪器：恒温培养箱、微量生化管、电子显微镜、超净工作台、立式压力蒸汽灭菌器、血平板、冰箱、摇床

3　方法

3.1细菌的富集将受试粪便样品分别编号，在超净工作台里进行严格无菌操作，在无菌条件下，称取单位粪便样本，接种到已经灭菌的普通肉汤培养基中，摇床培养（37℃，20or/hl i n）24h。

3.2细菌的分离在超净工作台里进行严格无菌操作，（实验前照紫外）实验前照紫外15m i n。用接种环将过夜培养的肉汤培养液在超净工作台上分别接种到血清普通琼脂培养基上，并且标明接种的编号。接种完成后将培养皿放入37℃恒温培养箱过夜培养18h-24h［8］。

3.3细菌的纯化培养在超净工作台上挑取培养皿中形态规则，色泽鲜明，无污染的3个菌落分别在装有肉汤的培养皿中37℃培养18~ 24 h，之后分别取培养好的细菌分别接种在3个普通培养皿上，编号1、2、3。把余下的纯化菌液分别装于3只高压灭菌的试管中，放进摇床中进行扩大培养，条件是37℃，200r/m i n，培养24h。

3.4细菌形态学观察取在琼脂平板上培养24h的新鲜菌落，进行形态观察和革兰氏染色镜检，将分离到的细菌进行纯培养，通过革兰氏染色后镜检观察细菌的形态。

3.5生化试验取纯培养物3～4个菌落接种到3mL营养肉汤，37℃培养18～24h。按姚火春（2002）介绍的方法进行生化试验，取10μL培养物接种肠杆菌科细菌生化编码微量鉴定管，37℃培养，2～3d内读取结果，根据伯杰氏（Bergey's）细菌鉴定手册作出鉴定（H ol t等，1984）。

3.6动物回归试验

3.6.1试验动物攻毒按麦氏比浊法配制成3×109 CFU/m L菌悬液。用扩大培养的菌液进行小白鼠腹腔注射，选取健康小白鼠40只，分成4组，每组10只，分别腹腔注射以下菌液（注射单位：菌悬液0.2m L/10g），第4组作为对照组（注射单位：0.2m L/l Og灭菌生理盐水）。攻毒时注意腹腔注射尽量避免把菌液注射到皮下，影响小白鼠发病以及死亡时间，做好染色标记。具体见下表。

菌液　组别　1组　2组　3组　4组屎肠球菌　0.2m l/只藤黄微球菌　0.2 m l/只无乳链球菌　0.2 m l/只灭菌生理盐水　0.2 m l/只

3.6.2试验动物剖检及细菌分离观察小白鼠攻毒后的精神状态和死亡时间，待试验动物死亡后，采用常规剖检方法，观察各个内脏器官的病理变化，取粪便以备细菌分离所用，剖检结束后进行细菌的分离，以上步骤均要求无菌。

3.6.3致病菌的鉴定从死亡的小白鼠肝脏分离的细菌进行革兰氏染色镜检，对比原始病料中分离的细菌，最终确定是否为主要致病菌。

4　结果与分析

通过对受检粪便样品的细菌的培养、分离、染色镜检、生化鉴定、动物回归试验，最后确定在昆明动物园饲养的火烈鸟粪便中分离培养得到的细菌为屎肠球菌、藤黄微球菌、无乳链球菌。

4.1显微镜观察形态及染色

4.1.1屎肠球菌在显微镜观察到的结果革兰氏阳性菌，为圆形或椭圆形、呈链状排列的球菌，无芽胞，无鞭毛。

4.1.2藤黄微球菌在显微镜下观察到的结果。革兰氏阳性菌，八个菌体聚在一起，或者单个、成双、四联排列或呈立体包裹状不规则，菌落直径一般为1.0～1.5微米。

图1　显微镜下观察到的菌落

图2　显微镜下观察到的菌落Fi gure2 Col onywasobserved undert hem i croscope

4.1.3无乳链球菌在显微镜下观察到的结果

革兰氏阳性球菌，单个、成双、链状排列、长短不一。

图3　显微镜下观察到的菌落Fi gure3 Col onywasobserved undert hem i croscope

4.2生化鉴定结果

4.2.11号管生化试验结果

注：“+”为阳性反应，“-”为阴性反应Not e："+"ast heposi t i vereact i on，"-"ast henegat i vereact i on

理化特性参照《常见细菌系统鉴定手册》［9］，与判断标准比较后，分离培养到的1号菌株与屎肠球菌的判断标准符合，说明1号菌为屎肠球菌。

4.2.22号管生化试验结果

注：“+”为阳性反应，“-”为阴性反应Not e："+"ast heposi t i vereact i on，"-"ast henegat i vereact i on

理化特性参照《常见细菌系统鉴定手册》［9］，与判断标准比较后，分离培养到的2号菌株与藤黄微球菌的判断标准符合，说明2号菌为藤黄微球菌。

4.2.33号管生化试验结果

注：“+”表示90%以上为阳性，“V”表示阴性，“-”表示0-9%为阳性。Not e："+"saysm ore t han 90%posi t i ve，"V"sai d negat i ve"-" sai d 0-9%i sposi t i ve理化特性参照《常见细菌系统鉴定手册》［9］，与判断标准比较后，分离培养到的3号菌株与无乳链球菌的判断标准符合，说明3号菌为无乳链球菌。

4.3动物回归试验结果

4.3.1试验动物攻毒将细菌扩大培养物对小白鼠进行腹腔注射后，小白鼠反应情况，具体结果见下表。

试验动物　攻毒剂量（m l）　对照组（m l）屎肠球菌　藤黄微球菌　无乳链球菌　灭菌生理盐水0.2　0.2　0.2　0.2试验小鼠（只）　10　10　10　10死亡小鼠（只）8　9　0　0

4.3.2试验动物病理剖检及致病菌鉴定通过对死亡小白鼠进行病理剖检发现，注射屎肠球菌菌液的小白鼠，肉眼观察到脾肿体积增大，肠壁有大量出血点；注射藤黄微球菌菌液的小白鼠，肝脏肿大坏死，心外膜存在大量出血点；注射无乳链球菌菌液的小白鼠不死亡，剖检无任何变化；对照组不死亡。分别取4组小白鼠的粪便进行细菌分离，置于37℃恒温培养箱中进行培养，挑取单个菌落进行革兰氏染色再镜检，再次进行生化试验，注射屎肠球菌菌液的小白鼠均检测到了屎肠球菌；注射藤黄微球菌菌液的小白鼠均检测到了藤黄微球菌；注射无乳链球菌菌液的小白鼠均检测到无乳链球菌，因此判断屎肠球菌和藤黄微球菌为该病的主要致病菌。

5　讨论

此次从患病火烈鸟粪便内检测到屎肠球菌、藤黄微球菌和无乳链球菌，与同为禽类的观赏鸟类---孔雀作比较，结果有所不同，在孔雀发生腹泻、急性死亡情况下多数检测到大肠杆菌，或者是新城疫与大肠杆菌的混合感染［10］，而火烈鸟粪便中却没有检到大肠杆菌。本研究通过对昆明动物园火烈鸟粪便的细菌检测，最终在此火烈鸟粪便检测到三种细菌。未见其他细菌，可能和平时养殖过程中使用的抗菌素等药物有一定关系。

6　结论

火列鸟腹泻粪便中分离得到屎肠球菌、藤黄微球菌、无乳链球菌；其中屎肠球菌、藤黄微球菌具有致病性。

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