猴头菌麦角甾醇高产菌株选育及深层培养条件的优化

□ 蔡佳佳　张　岩　邢春玉　郭　美　李雪莹　白芯语　天津天狮学院生物与食品工程学院

猴头菌麦角甾醇高产菌株选育及深层培养条件的优化

□ 蔡佳佳张岩邢春玉郭美李雪莹白芯语天津天狮学院生物与食品工程学院

通过单因素实验确定猴头菌液态发酵培养的最优碳源、氮源、无机盐；在此基础上，采用三因素三水平正交实验方法，确定液态深层发酵的培养条件；采用自然选育和紫外诱变法，筛选出麦角甾醇产量较高的猴头菌株。结论表明：葡萄糖2%、酵母膏0.5%、磷酸二氢钾0.15%、硫酸镁0.075%、蛋白胨1%、起始pH值5.0、装液量80 mL、接种量6 mL，温度23℃、摇床转速150 r/min条件下，猴头菌生长情况良好；紫外线照射40 s的菌株在平板培养基上生长最好，摇瓶发酵后发酵液、菌丝球、菌丝粉中麦角甾醇含量分别为：0.062 25 mg/10 mL、9.686 2 mg/g、18.440 3 mg/g，明显高于对照组。

猴头菌；麦角甾醇；高产菌株；紫外诱变

猴头菌又称猴菜、猴头菇、对脸蘑[1]，属于担子菌亚门猴菇科猴菇属的大型食用菌、药用菌[2]，能够促进血液循环，抑制肿瘤细胞生长，对胃粘膜有很好的保护作用[3]，其中甾醇类物质具有降血脂、预防心血管疾病、延缓衰老等作用，也是多种激素、维生素D合成的前体[4]，在物质运输等方面起着重要作用[5]。近年来，我国消费者对麦角甾醇的需求量呈逐年增长趋势，麦角甾醇高产菌株的选育就显得尤为重要。

目前，研究还是以猴头菌子实体居多，但子实体的生产性能不稳定，不能保证对原料质量稳定的要求，而液态深层发酵生产周期短、菌龄一致、菌丝生长速度快、接种简单、不受季节的限制可以周年生产，保证了猴头菌在生产过程中的可控性及目标产物的品质稳定性。通过对猴头菌液态培养基及培养条件的优化，筛选出猴头菌最适深层培养条件[6-9]，为猴头菌菌丝体高收率的生产提供一条便捷高效的生产途径，进而满足人们日益增长的需求。

1　材料与方法

1.1菌种

猴头菌种为天狮学院生物与食品工程学院实验室保藏菌种。

1.2主要仪器及试剂

恒温培养振荡器（HNY-2102C型，天津市欧诺仪器仪表有限公司）；数显式电热恒温水浴锅（XMTD-204型，天津市欧诺仪器仪表有限公司）；高压蒸汽灭菌锅（MJ-78A型，施都凯仪器设备（上海）有限公司）；低速离心机（TD5K-III型，长沙东旺实验仪器有限公司）；精密电子天平（BSA124S型，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）；生化培养箱（MI-80A型，施都凯仪器设备（上海）有限公司）；循环水式多用真空泵（SHB-III型，郑州长城科工贸有限公司）；单光束紫外可见分光光度计（UV 1000型，上海天美科学仪器有限公司）。

麦角甾醇标准品100 mg（纯度≥98% 上海圻明生物科技有限公司）；马铃薯（市售）；葡萄糖、蔗糖（分析纯，天津市北方天医化学试剂厂）；可溶性淀粉（分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司）；麦芽浸粉（分析纯，北京奥博星生物技术有限责任公司）；蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、胰蛋白胨（生物试剂，北京奥博星生物技术有限责任公司）；琼脂粉（分析纯，上海蓝季科技发展有限公司）；硫酸镁、磷酸二氢钾、硫酸锰（分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司）；硫酸铁铵（分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司）；冰乙酸（分析纯，天津市盛淼精细化工有限公司）；石油醚（分析纯，天津市北方天医化学试剂厂）；95%乙醇（分析纯 天津市北方天医化学试剂厂）。

1.3培养基

1.3.1斜面、平板培养基

马铃薯30%（煮汁），蛋白胨0.5%，葡萄糖2%，琼脂1.3%，pH自然。

1.3.2初筛液体培养基

用2%木屑提取汁溶解：葡萄糖2%，蛋白胨0.5%，磷酸二氢钾0.15%，硫酸镁0.075%，pH自然。

1.3.3液体发酵培养基

单因素实验基础培养基：葡萄糖2%，蛋白胨0.5%，磷酸二氢钾0.15%，硫酸镁0.075%，pH自然。

分别选择碳源：葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、麦芽浸粉、葡萄糖+可溶性淀粉。氮源：蛋白胨、酵母膏、胰蛋白胨、牛肉膏。无机盐：磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸锰。将上述不同碳源、氮源和无机盐分别替代基础培养基中的葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾和硫酸镁，分别组成不同的碳源、氮源、无机盐液体发酵培养基。

1.4菌种活化、复壮及初筛

转接保藏的猴头菌菌种，分别接种于新鲜斜面培养基活化，23℃培养5～7 d。

将活化菌种接种于初筛液体培养基中，23℃、150 rpm下培养6~8 d。取适量猴头菌培养液，经无菌漏斗过滤制备单孢子液。将单孢子液进行梯度稀释。选取连续3个稀释度，将稀释孢子液0.1 mL分别涂布于平板培养基中，于23℃下培养分离单菌落。经分离纯化选取菌丝体生长速度快的猴头菌株，截取边缘的幼龄菌丝，转接于斜面培养基，于23℃下培养5 d。

1.5菌株紫外诱变

将初筛菌株，以单因素实验中的最合适条件摇瓶培养5~7 d后，取20 mL的猴头菌发酵液，制备单孢子液。经梯度稀释后，选取连续3个稀释度的单孢子液分别倒入直径为90 mm的无菌培养皿，进行紫外线照射。以不经紫外线照射的单孢子液作对照，分别于平板培养基中分离单菌落，每组重复2次。注意避光，黑纸包扎完好，于23℃培养5~7 d。

将紫外诱变后分离的单菌落的边缘幼龄菌丝，接种至斜面培养基培养5 d，接种至单因素实验基础培养基进行液体发酵6~8 d，测定麦角甾醇含量。

1.6菌株液态深层发酵培养条件优化

由单因素实验确定最适的碳源、氮源、无机盐，进而对碳源用量、氮源用量及无机盐用量进行三因素三水平的正交实验，以菌丝体收率为指标确定猴头菌液态发酵培养基成分的含量。

1.7菌丝体收率的测定

发酵液经真空抽滤，得猴头菌菌丝体，80℃干燥8～10 h，称重。

1.8麦角甾醇的测定

麦角甾醇含量的测定：铁矾显色法[10]。565 nm波长下测定吸光度，以麦角甾醇标准品质量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

分别测定发酵液、菌丝体、菌丝粉中麦角甾醇的含量，筛选出麦角甾醇产量较高的菌株。

2　结果与讨论

2.1碳源对猴头菌菌丝体生成量的影响

由图1、表1可知，碳源对猴头菌菌丝体的生长影响特别显著。其中葡萄糖的菌丝体收率为0.445 1 g/100 mL，可以作为液体培养的碳源。

2.2氮源对猴头菌菌丝体生成量的影响

由图2、表2可知，氮源对猴头菌菌丝体的生长影响特别显著。其中酵母膏对菌丝生长的促进作用较大，菌丝体干重为0.399 0 g/100 mL，其次为蛋白胨，所生成的猴头菌菌丝体的干重为0.214 6 g/100 mL，所以选择酵母膏和蛋白胨，作为液体培养的氮源。

2.3无机盐对猴头菌菌丝体生成量的影响

由图3、表3可知，无机盐对猴头菌菌丝体的生长影响特别显著。液态深层发酵时，在以磷酸二氢钾为无机盐的培养基中，有明显的促进作用，菌丝生长速度快、菌丝球小、数量多、发酵液颜色澄清；以硫酸镁、硫酸锰为无机盐的培养基，菌丝生长不佳，发酵液的颜色均有混浊且偏深色。故选择磷酸二氢钾作为液体培养的无机盐。

图1　不同碳源对菌丝体生成量的影响

表1　碳源的单因素实验方差分析表

图2　不同氮源对菌丝体生成量的影响

表2　氮源的单因素实验方差分析表

图3　不同种类无机盐对菌丝体生成量的影响

表3　无机盐的单因素实验方差分析表

2.4正交试验极差分析

2.4.1培养基成分正交实验极差

分析

由表4极差分析得出，葡萄糖用

量是影响菌丝体收率的最大因素，且RA>RB>RC，故各因素的主次顺序为A葡萄糖浓度，B酵母膏浓度，C无机盐浓度。A列因素：K2>K3>K1；B列因素：K2>K3>K1；C列因素：K3>K2>K1。最优方案为A2B2C3，即葡萄糖浓度为2%，酵母膏浓度为0.5%，磷酸二氢钾浓度为0.15%。此结论与表4中菌丝体干重最高组的实验结果相符，即试验号为“4”的方案为A2B2C3，其菌丝体干重为0.670 3 g/100 mL（正交实验中最高）。因此确定A2B2C3为最优方案。

2.4.2培养条件正交实验极差分析

由表5培养条件正交实验极差分析可知，对猴头菌深层发酵菌丝体收率影响最大的培养条件是装液量，且RB>RA>RC，故各因素的主次顺序为B装液量，A起始PH，C接种量。其中，A列因素：K1>K3>K2；B列因素：K1>K3>K2；C列因素：K1>K3>K2。最优方案为A1B1C1，即PH为5.0，装液量为80 mL，接种量为6 mL，在这个条件下经液体摇瓶培养的菌丝体干重最大，测定结果为0.688 9 g/100 mL。此结论与表5中试验号为“1”的培养条件下的菌丝体干重测定值相对应，即方案A1B1C1的菌丝体干重结果最高（为0.688 9 g/100 mL），符合正交实验极差分析结果。

2.5正交试验方差分析

2.5.1培养基成分正交实验方差分析

在方差分析中，因各实验条件下无重复，故以最小平方和列作为误差列，在a=0.05的情况下，进行F检验。本正交实验的方差分析中，以无机盐浓度偏差平方和作为误差，方差分析结果列于表6。

由表6可知，葡萄糖以及酵母膏对于猴头菌菌丝体生成的影响是显著的，其中葡萄糖的影响是特别显著的，而无机盐对其影响则不显著。结合正交实验极差分析结果，表明猴头菌菌丝体生成主要取决于液态培养基中的碳源和氮源。

2.5.2培养条件正交实验方差分析

在方差分析中，因各实验条件下无重复，故以最小平方和列作为误差列，在a=0.05的情况下，进行F检验。本正交实验的方差分析中，以接种量偏差平方和作为误差，方差分析结果列于表7。

由表7可知，初始PH、装液量及接种量对于猴头菌菌丝体生成的影响均为显著，其中装液量的影响是特别显著的。结合正交实验极差分析结果，表明猴头菌菌丝体生成与培养条件的关系较为密切，包括初始PH、装液量及接种量。

表4　培养基成分正交实验极差分析

表6　培养基成分正交实验方差分析

表7　培养条件正交实验方差分析

2.6正交实验验证实验

2.6.1培养基成分正交实验验证实验

将正交得出的最优方案组合A2B2C3进行验证，得出结果见表8。经验证实验，A2B2C3试验中猴头菌菌丝体干重的平均值为0.616 1 g/100 mL，故确定培养基成分的最优方案为A2B2C3。

2.6.2培养条件正交实验验证实验

将正交得出的最优方案组合A1B1C1进行验证，得出结果见表9。

经验证实验，A1B1C1试验中猴头菌菌丝体干重的平均值为0.662 4 g/100 mL，故确定培养条件的优方案为A1B1C1。

2.7紫外诱变菌体生长情况

每天定时观察平板培养基上的菌丝，记录其生长颜色、长势、边缘整齐度等情况，并对比，用“*”号表示菌丝生长普通、较一般，“**”号表示菌丝长势良好，“***”号表示菌丝生长最密、生长最好。记录情况见表10。

照射40、50、60 s的实验组，与对照组相比均有明显差异，均好于对照组，且照射40 s的实验组情况最理想：色泽度好、菌体生长整齐、单菌落面积最大。

2.8麦角甾醇含量测定

麦角甾醇标准曲线图，如图4所示。

由标准曲线方程y=1.202 1x-0.004 5，测定猴头菌不同样品中麦角甾醇的含量。样品为经液体摇瓶培养后所得猴头菌菌丝粉（水分为8.8%）、湿重菌丝球和猴头菌发酵液，结果见表11。

由表11可知，将各样品稀释液的吸光度A代入麦角甾醇质量曲线方程，再根据含量计算公式，得出菌丝粉中麦角甾醇含量为27.67 mg/g，湿重菌丝球中麦角甾醇含量为24.22 mg/g，发酵液中麦角甾醇含量为0.62 mg/100 mL。

表8　培养基成分正交实验验证实验

表9　培养条件正交实验验证实验

表10　菌体的生长状况

图4　麦角甾醇标准曲线图

表11　不同样品中麦角甾醇的含量

3　结论

对于猴头菌液态深层发酵优化培养条件和筛选麦角甾醇高产菌株，通过各项实验数据得出以下结论。

（1）综合单因素实验和正交实验结果，得出最适猴头菌液态深层培养条件为：葡萄糖2%，酵母膏0.5%，磷酸二氢钾0.15%，硫酸镁0.075%，蛋白胨1%，在PH5.0、装液量80 mL、接种量6 mL情况下，如果菌种活性良好，于23℃，150 r/min摇床培养，猴头菌菌丝体收率可达0.622 5 g/100 mL。

（2）诱变实验：比较经过不同时间的紫外照射后菌落的色泽、面积大小等总体生长状况，发现照射40 s＞60 s＞50 s＞对照组；且实验组紫外线照射后，发酵液、菌丝球、菌丝粉中麦角甾醇含量都比对照组高。可见在初筛的基础上，结合紫外诱变获得的菌株，其在固体培养基上的生长时间缩短，且菌丝体中麦角甾醇含量有所提高。相信经过连续适当的诱变处理，获得猴头菌的麦角甾醇高产的诱变菌株，可以作为生产菌种，能缩短工业化生产菌丝体的周期，提高生物产量。

［1］黄年来.自修食用菌学［M］.南京：南京大学出版社，1987.

［2］常明昌.食用菌栽培学［M］.北京：中国农业出版社，2003.

［3］曾化伟，郑惠华，梁伟，等.猴头菌液体发酵培养基的优选［J］.食品与发酵科技学报，2014（3）.

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［5］何秀萍，张博润.微生物麦角甾醇研究进展［J］.微生物学通报，1998（3）.

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［10］，中华人民共和国卫生部，中国国家标准化管理委员会.食品中胆固醇的测定（GB/T 5009.128-2003）［S］.2003.

天津市大学生创新创业训练计划（编号：201510859004）。