梅毒患者外周血CD4+、CD8+调节性T细胞表达的临床意义

杨静　孙兆伟　张渝

[摘要]目的：监测梅毒患者外周血CD4⁺、CD8⁺调节性T细胞的表达水平，考察其在临床的参考价值。方法：将2014年12月至2015年9月，我院收治并确诊的32例梅毒患者作为研究对象。其中，Ⅰ期、Ⅱ期、潜伏期梅毒患者分别有11例、15例和6例。采用细胞免疫芯片检测（淋巴细胞CD4⁺、CD8⁺绝对数检测）技术检测并计算患者外周血中的调节性T细胞CD4⁺、CD8⁺表达水平及CD4⁺、CD8⁺的比值。并与同期就诊我科的30例非梅毒患者的相应指标数据进行比较。结果：与非梅毒患者比较，梅毒患者外周血中CD4⁺、CD8⁺细胞绝对值计数均显著下降（P<0.05）；CD4⁺、CD8⁺比值显著低于非梅毒患者组（P<0.05）。在Ⅰ期、Ⅱ期、潜伏期梅毒患者间CD4⁺、CD8⁺绝对值计数均值水平的差异有统计学意义（P<0.05）。结论：在梅毒患者外周血中CD4⁺、CD8⁺表达水平及CD4⁺、CD8⁺比值均显著降低，而在梅毒感染的不同疾病发展时期CD4⁺、CD8⁺表达水平也有着显著的差异。

[关键词]梅毒；外周血；调节性T细胞；CD4⁺；CD8⁺

[中图分类号]R759.1 [文献标志码]A

目前临床针对梅毒的诊疗已有确定的诊断标准和治疗方案。梅毒的疾病转归中面临的主要临床难题在于梅毒复发和再感染问题。有观点认为，梅毒患者内部免疫系统对感染的防御中存在包括调节性T细胞CD4⁺、CD3⁺、CD8⁺等参与的免疫反应。本研究中着重对梅毒患者外周血调节性T细胞CD4⁺、CD8⁺的表达水平进行监测和探讨，拟考察其在临床的实践意义。现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料

将2014年12月至2015年9月，我院收治并确诊的32例梅毒患者作为研究对象。其中，男21例，女11例。年龄19～56岁。其中，Ⅰ期、Ⅱ期、潜伏期梅毒患者分别有11例、15例和6例。患者均符合国内对梅毒的诊断标准（2002年）。无心、肝、肺、肾等其他系统的严重合并症。其中，12例合并有非梅毒相关的感染。选择同期本科室就诊的非梅毒患者30例作为对照。受试者均经梅毒螺旋体特异抗体测定（抗-TP）、梅毒甲苯胺红不加热血清反应素试验TRUST等非特异性梅毒筛查试验，结合其它非梅毒专项检查方法确诊或排除梅毒。不同时期梅毒患者间、梅毒患者与非梅毒患者间，其在年龄、性别比例等临床资料比较的差异均无统计学意义（P>0.05）。但梅毒患者更易合并非梅毒性感染（P<0.05）。见表1。受试者均经知情同意。

1.2 研究方法

采用细胞免疫芯片检测技术。环境要求：室温20～30℃；湿度：35%-65%；血样要求：新鲜全血（8h内）K2 EDTA抗凝；严禁冷藏。常规采集新鲜血液20μL，K2 EDTA抗凝。操作流程：（1）稀释加样：子弹头加入380μL鳞酸盐缓冲液，反吸法取20μL静脉血样加至380μL鳞酸盐缓冲液中，充分混匀。（2）加样孵育：充分混匀，反吸法取5uL稀释血，加入玻片方框区域中央；湿盒内加入室温水，水平放置，孵育40min。（3）洗染计数：1）依次清洗：①1包鳞酸盐粉+400mL蒸馏水搅拌均匀旋转提拉至无色透明；②1包过氧化酶粉+500mL95%乙醇搅拌均匀（避光保存，12h后可使用）浸泡1min；③1000μL过氧化氢+400mL蒸馏水搅拌均匀浸泡4min；④400mL 75%乙醇旋转提拉至无色透明。2）干燥机吹干6min：1包复染粉+500mL 75%乙醇搅拌均匀（避光保存，12h后可使用），浸泡1min：5000mL蒸馏水浸泡30s后提拉出来，小于15片提拉3次，大于15片提拉5次，（每次更换）。3）干燥机吹干，自动计数。通过以上方法检测并计算受试者外周血中的调节性T细胞CI4⁺绝对数、CD8⁺绝对数、CD4⁺/CD8⁺的表达水平。在2h内完成标本检测。检测的试剂盒购自上海汇中生物科技有限公司。所有检测试剂盒均在有效期内，严格按照其说明书进行操作。采用统计学软件SSPS17.0对所得数据进行处理和分析。比较不同时期的梅毒患者间、梅毒患者与非梅毒患者的差异。

1.3 统计学分析

计量数据用（x±s）表示，用F检验或t检验：计数数据用x²检验：计量资料的比较用t检验，多个变量的均值比较采用Mann-Whitney U检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CD4²调节性T细胞表达水平的比较

经t检验，梅毒患者（包括Ⅰ期、Ⅱ期、潜伏期）外周血中调节性T细胞CD4⁺的表达水平，与非梅毒患者比较均显著降低（P<0.05）。经Kurskal-Walis检验，不同疾病分期梅毒患者中的该指标均值水平的差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.2 CD8⁺调节性T细胞表达水平的比较

经t检验发现，梅毒患者（Ⅰ期、Ⅱ期、潜伏期）外周血中调节性T细胞CD8⁺的表达水平，与非梅毒患者比较均显著降低（P<0.05）。经Kurskal-Walis检验，不同疾病分期梅毒患者中的该指标均值水平的差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。

2.3 调节性T细胞CD4⁺/CD8⁺比值的比较

经t检验发现，梅毒患者调节性T细胞CD4⁺/CD8⁺的比值，与非梅毒患者比较显著降低（P<0.05）。经Kurskal-Walis检验，不同疾病分期梅毒患者中的该指标均值水平的差异无统计学意义（P>0.05）。见表4。

3 讨论

调节性T细胞是具有独立功能的T细胞亚群。大量研究结果表明，CD4⁺、CD3⁺、CD8⁺等调节性T细胞在维持机体内环境的稳定、抗自身免疫性疾病、抗感染和抗肿瘤免疫等方面有重要作用。通常情况下调节性T细胞与其效应细胞处于相对平衡，以维持机体正常的生理状态。CD4⁺细胞为辅助性T淋巴细胞，CD8⁺是抑制性T淋巴细胞，CD4⁺、CD8⁺以及CD4⁺/CD8⁺直接协调一致的表达水平，才能维持机体具有正常的免疫应答反应。如CD4⁺、CD8⁺等T细胞的调节失衡或比例过高，则可能引起自身免疫性疾病的发生。资料显示，如机体感染梅毒螺旋体，则外周血中CD4⁺的表达水平下降：而CD8⁺的表达水平增加，将可能导致迟发性变态反应，临床表现为Ⅱ期梅毒、潜伏期梅毒的持续状态。CD8⁺淋巴细胞的表达异常，还将抑制梅毒螺旋体一抗体的形成，使梅毒螺旋体病毒得以繁殖与扩散。而梅毒患者体内CD4⁺/CD8⁺T细胞比例失衡，被认为与血清固定现象有关。推测可能在患者接受系统、规范的抗生素治疗的过程中，CD4⁺/CD8⁺T细胞调节失衡，故机体的细胞免疫功能受到了抑制，而此时体内却仍有少量的梅毒螺旋体菌感染的持续存在。此时如患者继续接受抗生素治疗，也无法再提高临床效果。有资料表明，早期梅毒患者皮损的浸润细胞中多有T淋巴细胞的优势表达。其中，I期梅毒患者CD4⁺淋巴细胞的表达占优势：Ⅱ期梅毒患者CD4⁺、CD8⁺淋巴细胞的绝对值数量相差不大。而在血清固定的梅毒患者，其外周血CD4⁺细胞表达水平显著降低（P<0.05）。本研究结果中，梅毒患者外周血中CD4⁺细胞绝对值计数显著下降（P<0.05），考虑为血清固定现象所致。

梅毒螺旋体等病毒侵入人体可损害患者的免疫系统，直接攻击CD4⁺T淋巴细胞，所以CD4⁺T淋巴细胞数绝对值可以一定程度上反映人体的免疫功能情况。资料表明，CD4⁺T细胞计数若小于200，或CD4⁺/CD8⁺比值小于0.20，则（多种）机会性感染的几率也显著增加。临床上，CD4⁺<250，CD4⁺/CD8⁺<0.7的患者视为细胞免疫严重低下，强烈建议进行免疫调节治疗。本研究中，梅毒患者更易合并非梅毒性感染（x²=7.14，P<0.05）。这一点与文献报道一致。

因CD4⁺细胞数绝对值可能随生理波动而有较大的波动，故目前认为，CD4⁺/CD8⁺的比值更能客观反映患者的感染情况。感染患者，其体内的CD4⁺/CD8⁺比值多在0.5以下。本研究结果发现，与非梅毒患者比较，梅毒患者CD4⁺/CD8⁺比值显著降低（P<0.05）。在梅毒感染的不同疾病发展时期，T淋巴细胞CD4⁺/CD8⁺的比值均有显著的变化。本研究如上结果与文献资料的报道也是一致的。

总之，梅毒患者外周血中CD4⁺、CD8⁺淋巴细胞的绝对值计数以及CD4⁺/CD8⁺比值均异常降低，且在梅毒感染的不同疾病发展时期CD4⁺、CD8⁺淋巴细胞的绝对值计数也有着显著的变化。提示如上指标在梅毒的疾病发生、发展中有着重要的临床意义。

（收稿日期：2015-10-26）