油茶籽饼中茶皂素定量检测方法研究

张团结，熊道陵，许光辉，陈　超，陈金洲（江西理工大学冶金与化学工程学院，江西赣州341000）

油茶籽饼中茶皂素定量检测方法研究

张团结，熊道陵，许光辉，陈超，陈金洲
（江西理工大学冶金与化学工程学院，江西赣州341000）

本文建立了一种快速、简单、准确测定油茶籽饼中茶皂素含量的方法。结果表明：采用分光光度法和高效液相色谱法对同含量的茶皂素测定结果较为吻合，相比之下分光光度法更为简单快捷。分光光度法是以香草醛-高氯酸作为显色剂，通过茶皂素甙元显色，于554 nm为检测波长。在样品待测液中，加入香草醛-高氯酸1.0 mL，在温度为60℃的条件下反应15 min，显色效果最佳。该方法精密度高，显色后在40 min内吸光度稳定，平均加标回收率为98.28% （RSD=3.86%）。本实验建立了分光光度法测定茶皂素含量的方法，具有良好的准确度、精密度和稳定性，可用于茶皂素含量的测定。

分光光度法，高效液相色谱法，茶皂素，甙元

油茶籽饼中的茶皂素是一类五环三萜类齐墩果烷型皂甙，不仅具有天然优良的表面活性作用，还有杀灭细菌、杀灭害虫、抑制细菌、消炎等作用［1-3］，故而被广泛地应用于农药、建材、化工等方面［2-5］。

从油茶籽饼中提取出的茶皂素含有蛋白质、多糖、单宁、油脂、树脂等杂质，使得茶皂素产品质量差，色泽深黑，且不同地域的茶籽中茶皂素因品种、栽培环境等不同而存在差异，给茶皂素定量研究带来很多的困难，因此迄今为止国内尚未见统一的检测方法。

茶皂素定量分析方法研究有：重量法［6］、显色法［7-9］、薄层扫描法［10］（TLC）、高效液相色谱法［11-12］（HPLC）等。其中重量法测定具有数值稳定性好、重现性强的优点，但是存在分析时间长，操作复杂，水解得到的皂甙存在纤维素等杂质，使得测定结果偏大等问题。显色法测定茶皂素的含量是一种快捷的方法，但是从油茶籽饼中提取出的茶皂素含有蛋白质、单宁、茶多酚、多糖等杂质对检测有很大的影响，常需要对这些杂质进行除杂方可进行显色检测。薄层扫描法和高效液相色谱法测定茶皂素的含量，对设备要求高，存在操作复杂，分析费用大等问题。本实验以茶皂素水解后的甙元含量来测定茶皂素的含量，有效的避免茶皂素中杂质对测定结果的影响，提高了茶皂素含量定量的准确性，无需对茶皂素进行复杂的提纯。本文测定方法比高效液相色谱法更为简单、方便、快捷，为开发油茶籽饼中茶皂素含量测定提供科学依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

无水甲醇、乙醇南昌全友化工原料有限公司（分析纯）；甲醇西陇化工股份有限公司（色谱纯）；香草醛天津市巴斯夫化工有限公司（分析纯）；高氯酸济宁恒泰化工有限公司（分析纯）；冰醋酸济宁佰一化工有限公司（分析纯）；盐酸深圳市庆茂化工有限公司（分析纯）；茶皂素标准品阿拉丁试剂有限公司（纯度＞98%）；样品茶皂素陕西帕尼尔生物科技有限公司（纯度＞40%）；超纯水实验室自制。

Agilent高效液相色谱仪美国安捷伦公司；ATX324分析天平上海圣科仪器设备有限公司；101系列数显鼓风干燥箱上海叶拓仪器仪表有限公司；UV-6300紫外分光光度计上海美普达仪器有限公司；HH恒温水浴锅江苏金坛市中大仪器厂；JJ-1电动搅拌器江苏金坛市中大仪器厂；R系列旋转蒸发器山海申生科技有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵巩义市英峪予华仪器厂。

1.2实验方法

1.2.1甙元的制备取3.0 g茶皂素标准品加入2.5 mol/L浓度的盐酸甲醇溶液在沸水浴中水解1 h，水解后得到灰色的茶皂素甙元，在80℃干燥箱内烘1 h得到茶皂素甙元，取29.0 mg甙元，用甲醇溶解并定容到50.0 mL容量瓶中，获得浓度为0.58 mg/mL的标品甙元溶液，用同样的方法可得到浓度为1.38 mg/mL的样品甙元溶液。1.2.2显色方法茶皂素结构属于齐墩果烷型，将皂素水解成甙元后利用分光光度法测定甙元的含量确定茶皂素的含量。茶皂素在沸水浴的盐酸甲醇溶液中水解1 h得到甙元，再和香草醛上的醛基发生反应形成缩醛，成为新的共轭体系而显色。

1.2.3测定波长的选择分别精密吸取标品甙元溶液和样品甙元溶液各0.50 mL于10.0 mL带有塞子的显色管中，水浴蒸干溶剂，加入香草醛-高氯酸（体积比1∶4）1.0 mL，摇匀，在60℃水浴锅中反应15 min，反应后冰水浴5 min，加入冰醋酸5.0 mL，以不加皂素甙元为空白试剂，在400～700 nm处扫描，确定最大吸收波长。

1.2.4显色条件的确定通过对影响显色的因素（显色剂用量、反应时间、反应温度）进行考察，得到最佳的显色条件。

取标品甙元溶液0.30 mL，80℃水浴挥干溶剂，冷却后，加入不同量的显色剂（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL），摇匀，在不同温度（45、50、55、60、65、70℃）水浴中加热不同时间（5、10、15、20、25、30 min），迅速冷却至室温，加入5 mL冰醋酸，在最大波长处测定吸光度值，确定最佳显色条件。

1.2.5标准曲线的建立精密吸取茶皂素标准品甙元溶液0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70 mL，分别置于10.0 mL带塞子的显色管中，加香草醛-高氯酸1.0 mL，摇匀，在60℃水浴锅中反应15 min。冷却后冰水浴5 min，加入冰醋酸5.0 mL，以不加皂素甙元为空白试剂，在最大吸收波长处测定吸光度。茶皂素含量计算公式见下式

式中：C为甙元含量（mg）；换算系数0.4921是茶皂素水解后产生的不溶于水的甙元占整个茶皂素的分子量百分比，茶皂素平均分子量为1203，甙元分子量为592；m为茶皂素样品的质量（mg）。

1.3高效液相色谱法测定茶皂素的含量

按照参考文献［13］方法改进，色谱条件为：色谱柱，Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相：甲醇-水（v∶v=9∶1）；检测波长为210 nm；柱温：25℃。

标准品处理：精密称取茶皂素标准品0.5 g（精确到0.0001 g），用甲醇超声溶解并定容到100 mL容量瓶中。分别移取1.00、3.00、5.00、7.00、9.00 mL于5个50 mL容量瓶中，并用甲醇定容溶解。经0.45 μm微孔膜过滤后上机分析，以质量浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算得到回归方程。

哦，他说得很有道理，想求真情真爱，首先要把爱的立足点建立在对方身上，自己奉献再多，最终还离不开这个“我”字，怎么让别人无私地爱自己呢？对，人想活得比一般人更有意义，必须让自己的思想脱俗……对，对，古为今用，传统文化所包含的深刻的人生哲理，的确值得我们借鉴……想着想着，不知不觉便向老人频频点起头来。忽然又有难题涌上心头，说道：“可是，婚前的恋爱路子已经走错了，既然夫妻过不来，就得打离婚的谱。”

样品茶皂素含量的测定：用分析天平称取样品茶皂素0.058 g（精确到0.0001 g），用甲醇超声溶解并定容于50 mL容量瓶中。经0.45 μm微孔膜过滤，用高效液相色谱进行测试分析。

茶皂素含量计算公式见下式：

式中：χ为样品溶液中浓度（g/mL），V为样品定容的体积（mL），m为样品的质量（g）。

2　结果与分析

2.1甙元显色测定结果

2.1.1最大吸收波长的确定从图1中可以看出在波长为554 nm时吸光度最大，因此确定测定茶皂素甙元的波长为554 nm。

2.1.2显色剂用量的确定显色剂用量与吸光度的关系如图2所示，实验表明，随着显色剂用量的增加，吸光度在用量为1.0 mL之前上升较快。当显色剂用量在1.0 mL之后吸光度趋于稳定，即反应已经完全，确定最佳用量为1.0 mL。

2.1.3反应时间的确定不同反应时间与吸光度值的关系如图3所示。实验表明，当反应时间小于15 min时，随着反应时间的逐渐增大，吸光度值随之增大，当反应时间达到15 min时，吸光度值达到最大。当反应时间超过15 min时，吸光度值有所下降，这是因为时间过长会破坏显色体系，所以，选择15 min为最佳反应时间。

图1　皂素甙元扫描图Fig.1　Saponin aglycone scan

表1　样品加标回收率实验结果Table 1　Recovery and precision data of sample

图4　反应温度对吸光度的影响Fig.4　Effect of reaction temperature on the absorbance

2.1.5标准曲线回归方程的建立以吸光度值为横坐标，茶皂素甙元含量（mg）为纵坐标绘制的标准曲线如图5所示。计算线性回归方程为：C=0.4231A+ 0.0037（R2=0.9976）。

图5　皂素甙元标准曲线Fig.5　Aglucone standard curve

2.1.6精密度实验精密吸取6份标品甙元溶液0.20 mL。实验表明，连续6次测的吸光度值分别为0.251、0.250、0.249、0.251、0.252、0.250，其RSD为0.105%，表明该方法具有良好的精密度。

2.1.7稳定性实验精密取标品甙元溶液0.30 mL。实验表明，标品甙元溶液在显色结束后的40 min内吸光度值保持在0.426左右，表明标品溶液显色结束后的40 min内吸光度值是稳定的。

2.1.8加标回收率实验按照实验方法，分别对5组不同含量的样品甙元中加入相同含量的标准品甙元进行回收率实验，结果见表1，由表1可知平均回收率为98.28%，其RSD为3.86%，表明分光光度法检测茶皂素含量具有较好的准确性。

2.2高效液相色谱法测定结果

经过紫外扫描实验可知，茶皂素标准品在210 nm处有最大吸收峰，见图6，因此本实验采用210 nm为检测波长。用标准品配制的5个不同浓度的标准液分别得出不同浓度下的峰面积，以质量浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，见图7，得到回归方程为y=1.15×106χ+3.0×106，R2=0.9981（y表示峰面积，χ表示浓度）。

图6　茶皂素标准品紫外吸收光谱图Fig.6　UV absorption spectrum of tea saponin standard

图7　茶皂素标准曲线（HPLC法）Fig.7　Tea saponin standard curve（HPLC）

2.3样品含量测定

分别使用两种方法对样品进行测定，平行五次，结果带入标准曲线，在根据标准曲线计算得到样品中茶皂素含量，结果分别见表2、表3。

表2　分光光度法测定五个平行样品结果Table 2　Determination results of 5 parallel samples by UV spectrophotometry

表3　HPLC法测定五个平行样品结果Table 3　Determination results of 5 parallel samples by HPLC

3　结论

经过两种方法的测定结果比较可知，采用分光光度法和高效液相色谱法测定同一含量的茶皂素样品，其结果大致相同。本文建立的分光光度法操作简单，对检测设备要求低，通过精密度实验、稳定性实验、回收率实验验证了该方法的可靠性，该方法测定时间短，方便、快捷，可用于茶皂素含量的测定，适合推广。

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Quantitative analysis of tea saponin from seed cake

ZHANG Tuan-jie，XIONG Dao-ling，XU Guang-hui，CHEN Chao，CHEN Jin-zhou （School of Metallurgy and Chemical Engineering，Jiangxi University of Science&Technology，Ganzhou 341000，China）

In order to establish a rapid，simple and accurate method of determining the content of tea saponin，spectrophotometry and HPLC methods were used.The quantitative analysis results for the same content of tea saponins from the two improved analysis methods were very accordant and the former was more simple.The employed coloring reagents was vanillin-acetic acid and the color determination of saponin content based on aglycone at the wavelength of 554 nm.Optimal color condition for sample solution were obtained as follows：color reagents 1.0 mL，temperature 60℃，reaction time 15 min.The color of the samples were stabled within 40 min and the average recovery was 98.28%（RSD=3.86%）with high precision.The method based on spectrophotometry including high accurate，precision and stability，it could be used for quantitative determination of tea saponin.

spectrophotometry；HPLC；tea saponins；aglycone

TS201.1

A

1002-0306（2016）04-0053-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.04.002

2015－05－25

张团结（1989-），男，硕士研究生，研究方向：再生资源综合利用，E-mail：zhangtj0175@126.com。

熊道陵（1965-），男，博士，教授，研究方向：再生资源综合利用，E-mail：dlxiongcs@163.com。

国家自然科学基金资助项目（51364014）；江西省科技厅资助项目（2013BBG70003）；江西省级大学生创新创业训练计划项目（201310407037，201310407057，201410407030）；江西省高校专业综合改革试点项目（SZG-14-01-01）资助。