基于巯基磷酸和巯基环糊精双修饰纳米金的修饰电极测定微囊藻毒素的研究

甘　科，赵　晖，王海英，王朝元，梁晓声，*（.中南民族大学生命科学学院，湖北武汉430074；.湖北出入境检验检疫局检验检疫技术中心，湖北武汉430050）

基于巯基磷酸和巯基环糊精双修饰纳米金的修饰电极测定微囊藻毒素的研究

甘科1，赵晖2，王海英1，王朝元1，梁晓声1，*
（1.中南民族大学生命科学学院，湖北武汉430074；2.湖北出入境检验检疫局检验检疫技术中心，湖北武汉430050）

为了快速灵敏的检测微囊藻毒素（MC）的含量，本研究根据微囊藻毒素LR亚型（MC-LR）的结构特点对纳米金进行了巯基β-环糊精和巯基磷酸的双修饰，建立了一种基于双修饰纳米金材料的微分脉冲伏安电化学分析方法检测MC。结果表明双修饰的纳米金对MC具有良好的吸附性能，其吸附量达到2.125 μg/mL，静态分布系数为5.67。利用电聚合中性红修饰的玻碳电极表面正电荷吸附双修饰纳米金材料制备电化学传感器，测定MC，结果表明该电极对MC-LR的线性范围为26 nmol/L～213 μmol/L，检测限为（3σ/S）19 nmol/L，且具有良好的抗干扰能力。

微囊藻毒素，纳米金，巯基磷酸，巯基环糊精，修饰电极

近年来地表水富营养化引起有害蓝藻水华的发生日益频繁，其中微囊藻毒素（MC）是目前已知的蓝藻水华污染过程中出现频率最高、产生量最大和造成危害最严重的藻毒素种类［1-2］，可污染饮用水或通过生物富集进入食物链中，具有多器官毒性、遗传毒性和致癌性［3］。

目前MC检测方法中，蛋白磷酸酶抑制法（PPIA）和免疫学检测方法多存在一定的误差，只能用于样品的粗筛选［4］；高效液相色谱法、液相色谱质谱联用法使用的仪器设备贵重且需专业的技术人员［5-6］。研究和建立简单、快速、灵敏的微囊藻毒素的电化学分析新方法具有潜在的应用价值。目前鲜有运用纳米金修饰电极来增强微囊藻毒素检测灵敏度的电化学分析的研究报道。

本研究根据MC的结构特点进行理性设计，由图1所示，对纳米金表面进行巯基磷酸和巯基环糊精的双修饰，修饰过的纳米金的表面的巯基环糊精的疏水空腔可与MC的疏水的苯环结构特异性结合，带负电荷的磷酸基团可与MC结构中带正电荷的精氨酸的胍基发生静电反应并特异性结合，从而使MC能够和表面双修饰的纳米金粒子牢固结合。当电极用表面双修饰的纳米金粒子进行修饰后，在适宜条件下，MC可通过特异性结合作用吸附于表面双修饰的纳米金修饰的电极表面，显著提高反应面积及特异性富集能力，从而提高对MC的检出率和检测的灵敏度，这将为MC的快速准确的检测提供新的思路。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

TW-ALGAE微囊藻毒素色谱纯，台湾藻研有限公司；氯金酸光谱，Sigma公司；对甲基苯磺酰氯、乙腈、硫脲、三氯乙烯、β-CD、中性红、苯丙氨酸、酪氨酸、精氨酸、尿素、dNTP、乙酸、K3Fe（CN）6、K4Fe（CN）6、甲醇等均购自国药集团化学试剂有限公司；其它试剂均为分析纯。

CHI 660E电化学工作系统上海辰华仪器有限公司；UV6100紫外分光光度计上海美普达；超声波清洗仪昆山市超声仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1纳米金的表面修饰

1.2.1.1单-（6-巯基）β-环糊精的制备将55 g β-环糊精（β-CD）加入435 mL的蒸馏水中，将溶有5.2 g NaOH的蒸馏水缓慢加入到β-CD的悬浮液中，一边滴加一边搅拌，滴加时间为8～10 min，最后β-CD完全溶于NaOH中，悬浮液变成透明的β-CD溶液。再将溶有7.96 g对甲基苯磺酰氯的24 mL乙腈逐滴滴到透明的β-CD溶液中，一边滴加一边用玻璃棒搅拌，滴加时间为10～12 min。滴加结束后，透明的β-CD溶液变成浑浊液。然后于恒温磁力搅拌器22℃下1000 r/min搅拌2.5 h。反应结束后离心分离得到上清液。将上清液于4℃放置半天，会有大量白色沉淀析出。再将白色沉淀以蒸馏水为溶剂75℃下重结晶两次，再冷冻干燥，得到干燥高纯度的磺化产物（β-CD-OTS）。将1.5 g磺化产物加入到75 mL的含有1.5 g硫脲的甲醇溶液（甲醇与水的配比为4∶1）中，于85℃的恒温水浴锅中冷凝回流两天。反应结束后在旋转蒸发仪中减压去除溶剂，最后得到白色的粉末，再用一定体积的无水甲醇洗涤白色粉末。用52 mL的10%的氢氧化钠溶液溶解洗涤后的白色粉末，在50℃的恒温水浴锅中反应300 min，再用盐酸溶液将pH调到2，最后加入3.75 mL的三氯乙烯，在23℃搅拌反应1 d，抽滤得到白色固体，经过2次重结晶得到纯度较高的单-（6-巯基）β-环糊精［7-8］。

1.2.1.2纳米金溶胶的制备采用柠檬酸三钠还原法制备纳米金颗粒［6］。具体步骤为：用milliQ超纯水配制500 mL 1 mmol/L的氯金酸溶液，把配好的氯金溶液转移至三口圆底烧瓶，机械搅拌下加热至剧烈沸腾。一旦氯金酸溶液开始剧烈回流（回流量1滴/s），拔出三口烧瓶上的玻璃塞，迅速加入配制的所有柠檬酸钠溶液（50 mL 38.8 mmol/L），重新塞好玻璃塞，回流15 min。此时可见溶液由黄色变透明再变黑再变紫最后变成酒红色，15 min后，关掉加热，反应溶液自然冷却至室温，使用50 mL注射器和Millipore 0.22 μm无菌滤器过滤冷却的金溶胶，过滤后的金溶胶转移至干净玻璃瓶，并用锡箔包被4℃保存。合成的纳米金519 nm吸收峰通过朗伯-比尔定律进行定量，对于13 nm纳米金，消光系数为2.7×108M-1·cm［9-10］。

1.2.1.3纳米金的巯基磷酸和巯基环糊精双修饰取13 nmol/L的纳米金20 mL，加入11.49 mg单-（6-巯基）β-环糊精，充分摇匀待固体溶解后加入1 mmol/L巯基磷酸100 μL，混匀，避光静置，2 h后使用。

1.2.2琼脂凝胶电泳实验琼脂糖凝胶电泳（Agarose Gel Electrophoresis）用来表征不同修饰纳米颗粒的表面电荷情况。电泳在0.8%的琼脂糖凝胶，缓冲液为TAE（40 mmol/L Tris-acetate，1 mmol/L EDTA，pH7.0），100 V的恒压模式条件下进行。

1.2.3微囊藻毒素LR亚型（MC-LR）的吸附量的测定取20 μL MC-LR（125 μg/mL）分别加入1 mL蒸馏水，1 mL未修饰的纳米金，1 mL修饰的纳米金中，充分混匀，离心取上清液进行吸光度测定（239 nm），计算吸附量和静态分配系数，吸附量=MC-LR总浓度-上清液中MC-LR浓度。

1.2.4识别吸附特性表示方法［11］识别性能通常用静态分配系数KD来表征。静态分配系数KD的定义为KD=Cp/Cs，Cp表示聚合物结合底物的浓度（μmol/g，相当于单位质量的吸附量），Cs表示溶液中底物的平衡浓度（μmol/L）。

1.3修饰电极的制备

1.3.1玻碳电极的预处理［12］直径为3 mm的玻碳电极先在金相砂纸上打磨，再依次用0.3、0.05 μm的Al2O3浆在麂皮上抛光至镜面。然后用水超声清洗数分钟后取出，依次用1∶1乙醇、1∶1 HNO3和超纯水超声清洗。置于0.5 mol/L硫酸（H2SO4）溶液中，在-0.2～1.5 V的电位范围内以0.5 V·s-1反复扫描至达到稳定的循环伏安图为止。最后在含1×10-3mol/L K3Fe（CN）6的0.2 mol/L KCl溶液中进行循环伏安扫描，以测试电极性能，扫描速度50 mV/s，扫描范围0.6～-0.1 V。

1.3.2聚中性红膜修饰纳米金电极的制备［13］预处理后的电极在0.025 mol/L磷酸缓冲液（pH5.5），0.5 mol/L KCl和1.0×10-4mol/L中性红溶液中于-1.0～1.4 V电位下引发10圈，再于-0.8～0.8 V电位下聚合30圈，即制成中性红聚合物修饰电极。

图1　双修饰纳米金特异性结合MC示意图Fig.1　An illustration of specific binding with bi-modified gold nanoparticles for MC

1.3.3表面修饰纳米金电极的制备聚合物修饰电极表面滴入双修饰纳米金，4℃放置12 h。

1.4电极伏安行为的测试

采用三电极体系：金电极为工作电极，饱和KCl甘汞电极为参比电极，铂电极为辅助电极。电极聚合前后及聚合电极修饰前后电极于1×10-3mol/L K3Fe（CN）6的0.2 mol/L KCl溶液中进行循环伏安扫描，扫描速度50 mV/s，扫描范围0.6～-0.1 V。中性红聚合物修饰电极于pH5.5的磷酸缓冲液中以不同的扫描速度进行循环伏安扫描扫描范围-0.8～0.8 V。

表面修饰纳米金电极微分脉冲伏安法（DPV）检测：聚合物修饰电极表面修饰双修饰纳米金后，置于含不同藻毒素浓度的1×10-3mol/L K3Fe（CN）6的0.1 mol/L KCl溶液中进行，扫描范围-0.2～0.6 V，其余条件默认。

2　结果与分析

2.1修饰纳米金对微囊藻毒素的识别吸附特性

图2　不同修饰纳米金的琼脂凝胶电泳Fig.2　Agarose gel electrophoresis of the different modified gold nanoparticles

如图2所示，经过巯基环糊精修饰的纳米金在凝胶中的迁移速率比没有修饰纳米金的迁移速率要快，纳米颗粒表面负电荷变多或水化半径变小会引起凝胶电泳运动速率变快。环糊精修饰在纳米金表面不带电荷，则说明环糊精修饰使得纳米颗粒水化半径变小；2和3泳道比较可知，经过巯基环糊精修饰后的纳米金再经过巯基磷酸修饰，运动速率变快，是由于磷酸化修饰使纳米金带上了更多负电荷，使巯基环糊精和巯基磷酸双修饰的纳米金的迁移速率要大于巯基环糊精修饰的纳米金；3和4泳道比较可知，加入微囊藻毒素之后迁移速度减慢，说明双修饰后的纳米金能够与微囊藻毒素结合，结合后的相互作用导致纳米颗粒水化半径变大，在电场下在凝胶中运动时空间位阻变大导致迁移速度减慢。

图3　双修饰纳米金对MC的识别吸附特性Fig.3　Absorption characteristics of bi-modified gold nanoparticles for MC

2.2纳米金对微囊藻毒素的识别吸附特性

如图3所示，双修饰纳米金与纳米金对微囊藻毒素的吸附量和静态分配系数有明显差异，其吸附量达到2.125 μg/mL，静态分布系数为5.67，双修饰纳米金的静态分配系数为未修饰纳米金静态分配系数的123倍，说明纳米粒子表面进行修饰的巯基环糊精和巯基磷酸能够分别与MC中的疏水苯环结构和精氨酸的胍基相结合，实现对MC的特异性的结合，从而富集水样或食品样品中的MC。

2.3中性红聚合物膜修饰电极的电化学性质

图4　中性红聚合物膜修饰电极的电化学性质Fig.4　Electrochemical behavior of polymerization of neutral red

为了实现双修饰纳米金对玻碳电极的修饰，先对玻碳电极进行中性红聚合物膜的修饰，聚中性红在中性pH下通常带正电，可以很好的吸附带负电的纳米金或修饰纳米金。图4为中性红聚合物膜修饰电极的电化学性质。图4a中随着在中性红溶液中循环伏安扫描圈数增加，0.2 V附近和-0.4 V附近峰电流逐渐增加，说明随着扫描圈数增加电极表面形成了中性红聚合物膜。其聚合机理主要是高电位引发中性红形成自由基，自由基进一步相互碰撞形成二聚体，进而形成低聚物和聚中性红聚合物膜。在-0.8～0.8 V内，峰电流均随扫描周数的增加而增大，说明中性红聚合物膜为导电膜。

图4b为中性红聚合物膜修饰电极在pH5.5浓度为0.1 mol/L的醋酸缓冲液（含0.1 mol/L KCl作为支持电解质）中，于-0.8～0.8 V电位范围内不同扫速下的伏安曲线。从图4b可以看出，随着扫描速度的不断增加，峰电流值也不断的增加，仍能得到对称性良好的CV图，表明固定在电极表面的中性红呈现出良好的氧化还原可逆性。同时峰电流与扫速成线性关系，这表明修饰电极在缓冲液中的电化学过程受表面控制。

2.4双修饰纳米金/中性红聚合物膜修饰电极的电化学响应

图5　修饰电极的循环伏安图Fig.5　Cyclic voltammogram of the modified electrode

图5为各种电极的电化学响应图。从图5中可见中性红聚合物在电极表面形成后，由于中性红聚合物膜导电，导致电极溶液的界面变大，从而峰电流也相应变大，吸附修饰纳米金后，电流显著变小，是因为吸附纳米金后表面带负电，阻止了同样带负电的六氰合铁基团的进入从而使电流变小。上述循环伏安表征表明，电极表面聚中性红修饰和该修饰电极进一步吸附带负电荷的双修饰纳米金颗粒均取得了成功。

2.5双修饰纳米金/中性红聚合物膜修饰电极的线性范围和检测限

聚中性红修饰电极结合双修饰的纳米金后于含不同藻毒素浓度的1×10-3mol/L K3Fe（CN）6的0.1 mol/L KCl溶液中进行微分脉冲伏安法扫描，结果见图6a，得到单一的峰，峰电流随藻毒素浓度增大而变小。以藻毒素浓度对数对峰电流见图6b，在26 nmol/L～213 μmol/L范围内，可得到线性良好的标准曲线y=-0.4764x+ 6.6915，R2=0.9966。检测限为（3σ/S）19 nmol/L。

2.6干扰物质对双修饰纳米金/中性红聚合物膜修饰电极的影响

当溶液中藻毒素浓度为1×10-6mol/L时，在1× 10-3mol/L K3Fe（CN）6的0.1 mol/L KCl溶液中进行微分脉冲伏安法扫描时，加入浓度为10倍的苯丙氨酸、酪氨酸、精氨酸、尿素、dNTP、乙酸无显著干扰。

将吸附双修饰纳米金后的中性红聚合修饰的玻碳电极在pH7.0的PBS中循环扫描50圈，再置于1× 10-3mol/L K3Fe（CN）6的0.1 mol/L KCl溶液中进行微分脉冲伏安法扫描，峰电位不变，峰电流下降了4.2%。同一条件下，连续10次测定同一支电极对1× 10-6mol/L藻毒素的响应电流，RSD为3.40%，表明该电极有较好的重现性。该电极不使用时，放置于4℃的PBS溶液（pH7.0）中保存。2周后电极的响应下降约8.5%。

3　结论

图6　微分脉冲伏安法（DPV）对不同浓度MC的信号响应Fig.6　Responses signal of differential pulse voltammetric analysis to different concentrations MC

通过琼脂糖凝胶电泳实验及吸附量的测定，表明针对微囊藻毒素结构特点设计的β-环糊精和磷酸双修饰纳米金颗粒实现了微囊藻毒素的特异性吸附。将双修饰的纳米金吸附于中性红修饰的玻碳电极表面制备了微囊藻毒素检测电极，在26 nmol/L～213 μmol/L范围内，可得到线性良好的标准曲线，具有良好的选择性，抗干扰能力强，使用方便，为水样及食品样品中MC的快速检测提供了新的方法。

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Determination of microcystins by electrode modified with bi-modified gold nanoparticles with mono-6-thio-β-cyclodextrin and thiol phosphate modification

GAN Ke1，ZHAO Hui2，WANG Hai-ying1，WANG Chao-yuan1，LIANG Xiao-sheng1，*
（1.Collage of Life Sciences，South-Central University for Nationalities，Wuhan 430074，China；2.Hubei Inspection and Quarantine Technology Center，Wuhan 430050，China）

In order to determinate microcystins fast and sensitively，an electrochemistry determination method of differential pulse voltammetry was established with bi-modified gold nanoparticles.The bi-modified gold nanoparticles were prepared by modifying gold nanoparticles with mono-6-thio-β-cyclodextrin and thiol phosphate based on the structural characteristics of microcystins.The bi-modified gold nanoparticles had an absorbance capability of 2.125 μg/mL and a static allocation coefficient of 5.67，respectively.Then microcystin was determined with the electrochemical sensor prepared with a glassy carbon electrode which modified with toluylene red polymer to get a positive charged surface for absorbing the bi-modified gold nanoparticles.The result showed that this method had a strong resisting interference ability with a linear range of determination from 26 nmol/L to 213 μmol/L and a detection limit of 19 nmol/L，respectively.

microcystins；gold nanoparticles；mono-6-thio-β-cyclodextrin；thiol phosphate；modified electrode

TS207.3

A

1002-0306（2016）04-0049-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.04.001

2015－05－29

甘科（1988-），男，在读硕士研究生，研究方向：微藻生物技术，E-mail：agan.201@163.com。

梁晓声（1984-），男，博士，讲师，研究方向：纳米生物技术，E-mail：liangxs@mail.scuec.edu.cn。

国家质检总局公益基金（201310141）。