黑曲霉内切菊粉酶基因在毕赤酵母中的表达及应用研究

王宁鹤，邢雪岩，封志媚，路福平，李 玉（工业微生物教育部重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津300457）

黑曲霉内切菊粉酶基因在毕赤酵母中的表达及应用研究

王宁鹤，邢雪岩，封志媚，路福平，李 玉*
（工业微生物教育部重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津300457）

利用PCR方法从黑曲霉（Aspergillus niger）基因组DNA中扩增内切菊粉酶（endo I）全长基因（1551 bp），经序列分析后将其连接到表达载体pPIC9K上，得到重组表达载体pPIC9K-endo I。重组质粒经Sac I线性化并电转化到毕赤酵母GS115，阳性转化子进行发酵产酶后考察其酶学性质。酶学性质研究表明，重组酶的最适pH和最适温度分别为5和60℃，重组酶在55℃下保温9 h后，重组菊粉内切酶仍残余83.2%的活性，表现出极高的热稳定性，Cu2+、Ag+对重组酶有明显的抑制作用。对内切菊粉酶水解菊粉的过程研究表明，重组内切菊粉酶能在8 h内将4%（w/v）菊粉水解为3～6个聚合度的低聚果糖，水解11 h后，低聚果糖得率达到63.5%，本研究为进一步开发以菊粉为原料生产低聚果糖的应用奠定了基础。

内切菊粉酶，毕赤酵母，酶学性质，转化率

内切菊粉酶（endo-inulinase）能够特异性的水解菊粉中β-2，1-果糖苷键［1］，最终生成聚合度为3～10的高纯度低聚果糖（GFn，Fn），低聚果糖是一种聚合度为2～7的功能性果聚糖，具有热值低、增殖人体内双歧杆菌、抑制肠道沙门氏菌和腐败菌的生长［2］的作用，能够促进肠胃功能，防止便秘提高人体免疫力［3-4］，还能抑制血糖、降低血脂［5］，因而在食品、保健品等行业有着广泛的应用。菊粉是一种廉价的糖源，广泛存在于菊科植物的根茎和块茎中，通常被作为食用或饲用原料，其真正的价值未得到发挥。应用内切型菊粉酶水解菊粉生产低聚果糖，不仅可以提高低聚果糖的纯度，还能降低成本，从而提高农副产品附加值，具有广阔的应用前景。

近年来国内外研究者已经分离出很多能够水解菊粉的微生物，其中包括酵母、霉菌、细菌等，国内外已报道了来源于无花果曲霉（Aspergillus ficuum）［6］、节

杆菌（Arthrobacter sp.）［7］、克鲁维酵母（Kluyveromyces）［8］、青霉（Penicillium）［9］、黑曲霉（Aspergillus niger）［10］等菊粉酶的基因的克隆及鉴定，但到目前为止，市售的菊粉酶仍为混合酶，即同时存在内切型菊粉酶和外切型菊粉酶，外切型菊粉酶会从菊粉非还原性末端水解菊粉生成果糖分子，这样就无法以菊粉为底物生产高纯度的低聚果糖，也就无法发挥菊粉作为功能糖原料的应有的价值。因此有必要利用基因工程的方法表达内切型菊粉酶蛋白，以满足以菊粉为底物生产低聚果糖的要求，进而才能对内切菊粉酶水解菊粉生产低聚果糖的转化过程进行深入的探讨。

本研究根据Genbank所报道的内切菊粉酶生物信息，设计引物，通过PCR技术从本实验室保藏的一株野生型黑曲霉（TCCC 41064）中克隆得到内切菊粉酶基因endo I，构建到表达载体pPIC9K上，得到pPIC9K-endo I重组质粒，并在毕赤酵母GS115中得到诱导表达，并进一步研究了内切菊粉酶的酶学性质及转化过程，以期为内切菊粉酶的工业化生产及水解菊粉生产低聚果糖的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

载体和质粒 黑曲霉TCCC41064、克隆宿主菌E.coli JM109、表达宿主GS115、表达载体pPIC9K均由本实验室保藏；克隆载体pMD19-T simple vector 购自Takara公司；LB培养基 蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化钠10 g/L，pH7.0；YPD固体培养基 蛋白胨20 g/L，酵母提取物10 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂2%（w/v）；MD筛选培养基、BMMY培养基、BMGY培养基 参考文献［11］所述方法配制；工具酶和试剂 DNA限制性内切酶、T4DNA连接酶、LA Taq DNA聚合酶、DNA Marker均购自TaKaRa公司；蛋白胨、酵母粉、菊粉和琼脂糖 购自上海生工；柱式DNA胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、氨苄青霉素（Amp）、遗传霉素（G418） 购自北京博大泰克公司。

TU-1810型紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；TC-512型PCR基因扩增仪 英国Techne公司；高速低温离心机 德国Eppendorf公司；HW SY21-K型电热恒温水浴锅 江苏国华仪器厂；水浴恒温振荡器 北京市长风仪器仪表公司；DYY-6D型电泳仪 北京市六一仪器厂；HPLC分析色谱仪 安捷伦科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 黑曲霉基因组DNA的制备 参见文献［12］所述方法。

1.2.2 引物设计与基因克隆 参考GenBank中已报道的黑曲霉（GenBank登录号：CAA07345和DQ233221）内切菊粉酶基因的DNA序列，应用primer 5引物设计软件设计1对引物，如表1所示，引物由奥科生物工程有限公司合成。

PCR扩增条件为：95℃5 min，94℃ 45 s，58℃40 s，72℃1.5 min，30个循环；72℃延伸10 min。

1.2.3 表达载体pPIC9K-endo I的构建 使用引物endo-F、endo-R和LA Taq DNA聚合酶扩增Endo I全长基因，扩增得到的序列连接到pMD19-T simple vector载体上，转化至大肠杆菌JM109，获得T-endo I重组质粒，然后将用EcoR I、Not I双酶切的目的片段与同样双酶切的pPIC9K载体相连，获得pPIC9K-endo I。重组载体构建示意图如图1所示。

图1 重组表达质粒pPIC9K-endoⅠ的构建Fig.1 Construction of the recombinant plasmid carrying the endo-inulinase gene

1.2.4 毕赤酵母电转化、高拷贝重组菌株以及摇瓶发酵 参见文献［12］所述方法。

1.2.5 内切菊粉酶酶活力测定 将适当稀释的200 μL酶液与800 μL底物（4%长链菊粉溶解在0.05 mol/L的HAC-NaAC的缓冲液中，pH4.6）混合，50℃下反应10 min后沸水浴灭酶。内切菊粉酶水解菊粉释放出来的还原性末端用DNS［13］法测定。在100℃煮沸10 min的灭活发酵液上清液作为阴性对照。内切菊粉酶的酶活力单位定义为反应体系中每分钟产生1 μmol还原糖所需的酶量为1个酶活力单位（U）。

1.2.6 重组酶的酶学性质研究

1.2.6.1 最适温度测定 取适当稀释的酶液200 μL，加入800 μL 4%菊粉（用0.05 mol/L的HAC-NaAC缓冲液配制），在不同温度（40、45、50、55、60、65、70、75℃下）条件下考察内切菊粉酶的活力。

1.2.6.2 最适pH测定 利用0.05 mol/L的HAC-NaAC缓冲液（pH3.5～11）配制4%的菊粉，测定在不同的pH条件下的内切菊粉酶活力。

1.2.6.3 热稳定性测定 将酶液在50、55、60、65℃下保存一定时间后然后快速冷却，测定残余酶活力。

1.2.6.4 酸碱稳定性的测定 将酶液置于不同pH的缓冲液中，于室温下放置60 min，经0.1 mol/L pH4.6的醋酸缓冲液稀释后，在50℃下测定剩余的酶活力。

表1 PCR反应引物Table1 PCR primers

1.2.6.5 金属离子对内切菊粉酶酶活的影响 pH4.6、50℃下，在4%菊粉（0.05 mol/L的HAC-NaAC缓冲液配制）800 μL与200 μL酶液反应体系中添加5 mmol/L的金属离子，考察金属离子对内切菊粉酶的影响。

1.2.7 内切菊粉酶水解菊粉产物的分析检测

1.2.7.1 酶解产物的TLC定性分析 4%菊粉（0.05 mol/L 的HAC-NaAC缓冲液配制）800 μL加入200 μL酶液，pH4.6、50℃下反应，定时取样，将反应后的产物在薄层层析板上进行定性分析，上样2 μL，然后进行展层，每次展开时间为20 min，展开剂为正丁醇-异丙醇-水-乙酸（体积比为7∶5∶4∶2）。每次展层结束后用电吹风吹干，展层2次。展层后，在薄层层析板上加入显色液（水235 mL，钼酸氨12 g，钼酸铈氨0.5 g，浓硫酸15 mL），于95℃烘干显色10 min，观察结果。

1.2.7.2 酶解产物的HPLC定量分析 4%菊粉（0.05 mol/L的HAC-NaAC缓冲液配制）800 μL加入200 μL酶液，pH4.6、50℃下反应8 h，并定时取样，而后将样品置于1.5 mL离心12000 r/min离心10 min，上清稀释后经0.45 μm超滤膜后进行分析。HPLC色谱条件：安捷伦高效液相色谱仪，自动进样器，TSK-GEL Amide-80 Series色谱柱（4.6 mm×100 mm，5.0 μm）蒸发光检测器；流动相为60%（v/v）乙腈水溶液，流速1 mL/min；进样量5 μL。利用低聚果糖标准样品，绘制质量与峰面积的标准曲线，将样品中各糖组分峰面积分别带入相应的标准曲线求出相应浓度，从而确定聚合度DP3～5的低聚果糖的含量。

2 结果和分析

2.1 表达载体pPIC9K-endo I的构建及鉴定

以黑曲霉TCCC 41064菌株DNA作为基因扩增模板，按照方法1.2.2用引物P1、P2进行PCR扩增。0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测发现，在1.5 kb附近有特异性的单一DNA条带与目的基因片段大小一致。将PCR产物与pMD19-T Simple Vector连接后委托北京华大基因有限公司进行测序，经过比对，PCR产物与GenBank上报道的endo-inulinase基因序列相似度为99.67%。

图2 endoⅠ基因PCR及重组质粒pPIC9K-endoⅠ酶切验证电泳图Fig.2 The electrophoresis of endoⅠgene and digesting recombinant vector with restriction enzymes

将扩增出的内切菊粉酶基因片段插入到表达载体pPIC9K上，构成重组质粒pPIC9K-endo I，重组质粒pPIC9K-endo I经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切鉴定，小片段为1500 bp左右目的基因，大片段为9000 bp左右的pPIC9K载体，验证正确，表明目的基因已插入到pPIC9K载体上。

2.2 重组毕赤酵母的发酵

电转化得到的转化子经验证后，按照1.2.4方法对该重组子进行摇瓶发酵，按照方法1.2.5对发酵上清进行了酶活检测，发酵液上清酶活达到13.5 U。

2.3 内切菊粉酶性质的研究

2.3.1 重组内切菊粉酶的纯化 发酵液上清SDSPAGE结果如图3（A）所示，由图可知，在66 ku处，重组菌株比对照组多出一条特征条带，重组酶纯化方法参考文献［13-14］，经纯化去除杂蛋白后得到单一的具有内切菊粉酶活性的蛋白（图3B），表明纯化效果良好，纯化出的活性蛋白表观分子量约为70 ku，略高于根据内切菊粉酶氨基酸序列计算得出的55 ku，这可能是由于蛋白折叠过程中的糖基化。

图3 SDS-PAGE分析蛋白纯化结果Fig.3 SDS-PAGE analysis of the purified protease

2.3.2 最适温度测定 为确定温度对酶活性的影响，测定了从40～75℃下的酶活性，结果如图4所示。结果显示，在40～60℃之间酶活随温度升高而增加，60℃时酶活达到最大，比从黑曲霉野生菌株［10］分离出的内切菊粉酶最适温度略高，超过65℃酶活下降较快，在温度低于45℃或者高于65℃的范围内均不好。

图4 酶的最适温度Fig.4 The optimum temperature of the recombinant enzymes

2.3.3 最适pH测定 为确定pH对酶活性的影响，测定不同pH下的酶活性，结果如图5所示，结果显示，在pH3.5～5.0范围内，酶活性随pH增加而升高，在pH5.0，酶活达到最大，pH超过6.0，酶活下降很快。

图5 酶的最适pHFig.5 The optimum pH and pH stability of recombinant enzymes

2.3.4 热稳定性分析 经过在50、55、60、65℃下条件下恒温水浴处理9 h后，酶的活性随时间变化过程如图6。

图6 酶的温度稳定性Fig.6 The thermostability of the recombinant enzymes

由结果可知，在60℃以下，内切菊粉酶有很好的稳定性。在55℃下保温9 h后，内切菊粉酶仍残余83.2%的活性，但当温度高于60℃时，酶的活性下降很快，在65℃保温9 h后酶几乎完全失活。

2.3.5 pH稳定性分析 为了确定pH对酶稳定性的影响，分别测定在内切菊粉酶在pH3.0～10.0下酶的活性，并与在标准条件下测定的酶活相比较，实验结果见图7。

图7 酶的pH稳定性Fig.7 The pH stability of recombinant enzymes

由结果可看出，在pH3.0～7.0，酶活性在原来的90%以上，在pH10.0仍有原来酶活的81.1%，由此可见，内切菊粉酶在pH3.0～10.0较为稳定，在偏酸性条件稳定性要高于碱性环境，并且随着pH升高，酶的稳定性下降加快。

2.3.6 金属离子对内切菊粉酶酶活的影响 为了测定金属离子对酶活的影响，在反应体系中添加了不同的金属离子，结果如表2所示，由表2可知，金属Mg2+、Ni2+、Li+、Na+对酶没有明显的激活或抑制作用，酶活性能保持原来的90%左右；而Cu2+、Ag+对酶有明显的抑制作用，酶活性在原来的50%以下。

表2 金属离子对内切菊粉酶活力的影响Table2 Effect of different cations on recombinant endo-inulinase activity

2.4 内切菊粉酶水解菊粉产物的分析检测

2.4.1 TLC分析内切菊粉酶水解菊粉产物 薄层层析（TLC）法检测反应产物，结果如图8所示，随着反应时间的延长，长链菊粉逐渐被水解为短链糖，反应8 h后，菊粉基本被完全水解为短链的低聚糖。

图8 薄层层析法检测菊粉水解产物Fig.8 The hydrolyzed products in different periods by TLC analyze

2.4.2 HPLC分析内切菊粉酶水解菊粉产物 不同来源的内切菊粉酶与菊粉的结合及作用方式有差别，从而生成产物的聚合度的分布也不同，而聚合度3～5的低聚果糖的营养价值要高于其他聚合度的低聚果糖。为考察产物聚合度的分布，对反应产物进行

HPLC分析，不同时期产物成分液相图显示，在最初120 min内，内切菊粉酶将菊粉水解为3～6糖，从图9中可以看出，三糖增加速率要远高于其他几种糖，随着时间的延长，5糖、6糖逐渐开始水解，最终将菊粉水解成以3～5糖为主的低聚糖，并伴随有少量的2糖生成。

图9 以菊粉为底物时水解产物液相分析Fig.9 The hydrolyzed products in different periods using inulin as the substrate by HPLC analyze

2.4.3 低聚果糖得率随水解时间的变化 在加酶量为20 U/g下，利用内切菊粉酶水解4%（w/v）的菊粉，结果如图10所示，从图中可以看出，菊粉水解速率由快变慢，5 h后水解反应趋于平缓，可能是由于随着反应的进行，反应体系粘度过高，不利于传质，从而抑制了酶的催化活性，导致水解反应减慢。图中表明在反应11 h后低聚果糖得率达到63.5%。

图10 低聚果糖得率随水解时间的变化Fig.1 0 The conversion rate of fructooligosaccharides with the change of hydrolysis time

3 结论与讨论

从黑曲霉中克隆得到的内切菊粉酶基因在毕赤酵母中过表达，得到了高纯度的内切菊粉酶酶液，研究表明Cu2+、Ag+对酶有明显的抑制作用；酶的最适pH和最适温度分别为5和60℃，而且该酶在55℃以下具有很高的热稳定性；对内切菊粉酶水解菊粉过程研究表明，内切菊粉酶在8 h内能将4%（w/v）菊粉水解为3～6个聚合度的低聚果糖，最终能将菊粉水解成以3～5糖为主的低聚糖，在转化11 h后，低聚果糖得率达到63.5%。

菊粉酶因微生物来源不同，其酶学性质也会存在一定的差异，如霉菌来源的菊粉酶的最适pH在4.5～7.0之间，酵母菌来源的菊粉酶在4.4～6.5之间，细菌来源的菊粉酶在4.8～7.0之间。通常，细菌和酵母菌来源的菊粉酶的最适温度比霉菌的高，黑曲霉作为重要的糖苷酶类来源的微生物具有重要的研究意义，黑曲霉（A.niger strain 12）［15］内切菊粉酶最适pH 为5.3，稳定区在4.0～7.5；最适温度为45℃，稳定区在40℃以下，均没有本实验所构建菌株酶学特性优良，王静［16］在水解菊粉反应过程中添加10 U/g Aspergillus ficuum产生的内切菊粉酶，在pH6.0、45℃条件下反应72 h后，低聚果糖产量超过50%，主产物是DP2到DP4的低聚果糖。而本实验采用的重组内切菊粉酶能够在8 h内将菊粉水解为3～6个聚合度的低聚果糖，11 h后低聚果糖得率达到63.5%，水解时间短，低聚果糖得率高，符合水解菊粉生产低聚果糖的

基本要求，以上表明本研究构建的黑曲霉来源的内切菊粉酶具有很高的实用性，为利用菊粉生产低聚果糖的工业化提供了重要指导意义。

［1］Respondek F，Swanson K S，Belsiro K R，et al.Short-chain fructooligosaccharides influence insulin sensitivity and gene expression of fat tissue in obese dogs［J］.Journal of Nulrilion，2008，138（9）：1712-1718.

［2］Respondek F，Goachet A G，Julliand V.Effects of dietary short-chain fructooligosaccharides on the intestinal microflora of horses subjected to a sudden change in diet［J］.Journal of Animal Science，2008，86（2）：316-323.

［3］Morita T，kasaoka S，Ilase K，et al.Oligo-L-methionine and resistant protein promote cecal butyrate production in rats fed resistant starch and fructooligosaccharide［J］.Journal of Nulrilion，1991，129（7）：1333-1339.

［4］Li D，kim J M，Jin Z，et al.Prebiotic effectiveness of inulin extracted from edible burdock［J］.Anaerobe，2008，14（1）：29-34.

［5］Mesa M D，Silvan J M，Olza J，et al.Antioxidant properties of soy protein-fructooligosaccharide glycation systems and its hydrolyzates［J］.Food Research International，2008，41（6）：606-615.

［6］Uhm T B，Chae K S，Lee D W，et al.Cloning and nucleotide sequence of the endoinulinase-encoding gene，inu2，from Aspergillus ficuum［J］.Biotechnology Letters，1998，20（8）：809-812.

［7］Kang SII，Chang Y J，Oh S J，et al.Purification and properties of an endo-inulinase from an Arthrobacter sp.［J］.Biotechnology Letters，1998，20（10）：983-986.

［8］Zhang T，Chi Z，Chi Z，et al.Expression of the inulinase gene from the marine derived Pichia guilliermondii in Saccharomyces sp.W0 and ethanolproduction from inulin［J］.Microbial Biotechnology，2010，3（5）：576-582.

［9］Nakamura T，Shitara A，Matsuda S，et al.Production，purification and properties of an endoinulinase of Penicillium sp.TN-88 that liberates inulotriose［J］.Journal of Fermentation and Bioengineering，1997，84（4）：313-318.

［10］Ohta K，Akimoto H，Matsuda S，et al.Molecular cloning and sequence analysis of two endoinulinase genes from Aspergillus niger［J］.Bioscience，Biotechnology and Biochemistry，1998，62（9）：1731-1738.

［11］胡世界，罗素兰，张吉贞，等.巴斯德毕赤酵母表达系统及其高水平表达策略［J］.生物技术，2007，17（6）：79-83.

［12］李长青，薛永常.5种快速提取黑曲霉基因组DNA方法的比较［J］.中国生物制品学杂志，2014，27（5）：725-726.

［13］Cho YJ，Yun JW.Purification and characterization of an endoinulinase from Xanthomonas oryzae No.5［J］.Process Biochem，2002，37（11）：1325-1331.

［14］Shi XL Feng，MQ Shi J.High-level expression and purification of recombinant human catalase in Pichia pastoris［J］.Protein Expression and Purification，2007，54（2）：193-203.

［15］Ohta K，Akimo to H，Mo riyama S.Fungal Inulinase：enzymology，molecular biology and biotechno logy［J］.J Appl Glycosci，2004，51：247-254.

［16］王静，金征宇，江波，等.Aspergillus ficuum菊粉酶的分离纯化及其酶解菊粉制备低聚果糖［J］.食品与生物技术学报，2006，25（1）：1673-1689.

Overexpression of the endo-inulinase gene from Aspergillus niger in Pichia pastoris and its application research

WANG Ning-he，XING Xue-yan，FENG Zhi-mei，LU Fu-ping，LI Yu*
（Key Laboratory of Industrial Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science＆Technology，Tianjin 300457，China）

The endo-inulinase gene（1551 bp）was amplified from the total DNA of A.niger by PCR and subsequently cloned into pPIC9K.The recombinant plasmid was linearized by Sac I and transformed into P.pastoris GS115 by electroporation，yielding the recombinant strain P.pastoris GS115/pPIC9K-endo I.Then right transformants were isolated and the recombinant enzyme derived from fermentation was characterized.Its optimal pH and optimum temperature of the recombinant enzyme was 5 and 60℃，respectively，moreover 83.2%of the original enzymatic activity remained after the incubation of recombinant enzyme at 55℃ for 9 hours.It was shown that Cu2+，Ag+strongly inhibited the recombinant enzyme activity.The hydrolytic process analyses showed that the recombinant endo-inulinase could hydrolyze 4%（w/v）inulin into DP3-6 of fructooligosaccharides in 8 h.The conversion rate reached 63.5%in 11 h.The research laid a foundation for the produce of fructooligosaccharides.

endo-inulinase；Pichia pastoris；enzyme characterization；conversion rate

TS201.3

A

1002-0306（2016）08-0219-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.08.037

2015－09－10

王宁鹤（1990-），男，硕士研究生，研究方向：酶工程，E-mail：wnh1991@sina.com。

*通讯作者：李玉（1976-），女，博士，教授，研究方向：应用微生物与酶工程，E-mail：liyu@tust.edu.cn。

食品新酶创制与应用关键技术研究（2013AA102106-07）；天津科技大学青年教师创新基金（2014CHG08）。