鼠李糖乳杆菌发酵南瓜汁过程中挥发性物质的变化

彭兴兴，林伟锋，陈 中（华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510640）

鼠李糖乳杆菌发酵南瓜汁过程中挥发性物质的变化

彭兴兴，林伟锋，陈 中*
（华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510640）

为了比较不同发酵时间对鼠李糖乳杆菌发酵南瓜汁中挥发性成分的化学组成的影响，采用顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱联用技术对发酵南瓜汁的挥发性成分进行分析鉴定。结果表明发酵时间不同，发酵南瓜汁中挥发性物质在种类和含量上均存在差异，其中，发酵12 h时共鉴定出52种挥发性成分，含量较高的挥发性物质主要是3-羟基-2-丁酮（16.06%）、2，4-二叔丁基苯酚（8.05%）、乙醇（6.84%）；发酵24 h时共鉴定出41种挥发性成分，含量较高的挥发性物质主要是2，3-丁二酮（20.46%）、3-羟基-2-丁酮（10.8%）、乙酸（9.97%）；发酵36 h时共鉴定出40种挥发性成分，含量较高的挥发性物质主要是乙酸（13.98%）、2，3-丁二酮（12.35%）、3-羟基-2-丁酮（10.26%），发酵48 h时共鉴定出37种挥发性成分，含量较高的挥发性物质主要是乙酸（21.48%）、3-羟基-2-丁酮（14.2%）、2，3-丁二酮（12.3%）。

发酵南瓜汁，顶空-固相微萃取，气相色谱-质谱联用，鼠李糖乳杆菌，挥发性成分

南瓜是一种人们生活中常见的瓜果类蔬菜之一，近年来人们研究发现南瓜不仅营养丰富，而且含有大量生理活性物质，具有多种药用价值［1-2］，南瓜的综合加工广泛开展，市面上已涌现出各种南瓜加工品。关于南瓜的研究主要集中于加工工艺方面［1］，对其风味的研究较少。

食品的风味是构成食品美感的最重要的因素。南瓜虽然具有令人喜爱的清香味，但在南瓜汁的加工过程中，需要经过热烫、均质和杀菌等加工环节，这会使南瓜产生一定的“蒸煮味”，使得南瓜饮料不为人接受。饮料风味可以通过益生菌发酵改善，利用乳酸菌发酵南瓜而制成的南瓜乳酸菌饮料，不仅具有良好的风味，而且富含多种营养成分，提高了饮料的生物学价值，是一种保健功能很高的营养食品［3］。

国内外已有对新鲜南瓜、南瓜汁及发酵南瓜汁的挥发性组分进行过研究，李瑜从南瓜中鉴定出44种化合物，从南瓜汁中鉴定出53种化合物［4］；周春丽等用固相微萃取分别从乳酸菌、酵母菌和二者混合发酵南瓜汁中鉴定出51、36和45种挥发性化合物［5］，但利用鼠李糖乳杆菌发酵南瓜汁过程中，其挥发性物质变化的研究尚未见报道。

固相微萃取（SPME）是一种新的萃取技术，萃取条件温和，萃取过程中风味物质损失少，现已广泛用于食品风味研究。本文通过顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱（GC-MS）联用技术，对鼠李糖乳杆菌发酵南瓜汁过程中挥发性物质的变化进行研究比较，并对其中一些物质的形成机理做初步探索，从而为南瓜汁发酵饮料的生产提供一定技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

市售南瓜 购买于华南理工大学后勤集团，室温贮藏；鼠李糖乳杆菌 源于华南理工大学轻工与食品学院实验室。

超净工作台 苏州净化设备有限公司；隔水式保温箱 上海福玛实验设备有限公司；JM-L150胶体磨 温州市龙湾永兴张祥胶体磨厂；固相微萃取头 75 μm CAR/PDMS；DSQ II气相色谱-质谱联用仪美国Thermo公司。

1.2 实验方法

1.2.1 南瓜汁的制备 选择较新鲜完好，且具有较适宜的成熟度的南瓜。将清洗后的南瓜先切成小颗粒备用，按照南瓜∶水（重量比）=1∶1的比例，将南瓜和水适量的逐渐放入胶体磨中研磨两次，将研磨好的南瓜汁在90～95℃内，杀菌加热10 min。

1.2.2 样品制备 将活化后的鼠李糖乳杆菌以106cfu/mL的接种量接入灭菌南瓜汁中，在37℃恒温条件下分别发酵12、24、36、48 h，分别吸取发酵液8 mL 与1 g氯化钠混合，加入到样品瓶中，加盖封口。

1.2.3 气相色谱条件 参照Verzera A等［7］的方法，样品通过TR-5ms弹性石英毛细色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）进行分离；升温程序条件：起始温度45℃，保留2 min，以5℃/min升到150℃，保持1 min，再以10℃/min升至220℃，保持4 min，载气为高纯氦气（1.0 mL/min）；进样口温度250℃，分流比10∶1。

质谱条件：电子轰击电离（EI）离子源，电子能量70 eV；电子倍增器电压350 V；离子源温度230℃；传输线温度250℃；质量范围35～350 m/z。

1.2.4 数据处理 实验数据采用Origin 8.0软件处理分析，显著性水平为0.05，当p＜0.05时表示差异显著。挥发性化合物的鉴定根据NIST08数据库检索，选择正反匹配度均大于800的物质作为有效的鉴定结果。

2 结果与分析

利用SPME富集，通过GC-MS法对不同发酵时间点下南瓜汁挥发性组分进行检测，根据气相色谱、质谱分析与谱图检索，挥发性风味成分的鉴定结果见表1。

表1 不同发酵时间下发酵南瓜汁挥发性成分分析Table1 Volatile components of pumpkin fermentation juice with different duration

续表

续表

2.1 南瓜汁的挥发性物质分析

由表1可见，南瓜汁的挥发性物质经质谱鉴定出27种化合物，其中，醛酮类鉴定出8种，占19.28%；醇类鉴定出5种，占13.7%；酚类物质2种，占8.89%；酸类1种，占1.1%；酯类2种，占3.31%；烷烃类6种，占6.22%；其他类2种，占1.15%。含量较高的挥发性物质分别是己醛（13.4%）、2，4-二叔丁基苯酚（8.36%），在所有的挥发性成分中，含量最高的是醛酮类化合物，其次是醇类物质，这一结果与李瑜和周春丽研究南瓜汁挥发性风味物质的结果是一致的［4-5］。一般说来，链状的醇、醛、酮、酸、酯等化合物，在低分子量范围内由于挥发性强，官能团的比重大，官能团特有的气味也较强烈。随着分子碳链的增长，化合物的气味也由果实香型→清香型→脂肪臭型的方向变化，而且气味的持续性也随着增强［7］。南瓜汁中具有较多C4-C9的醇类和醛酮类物质，其中己醛、环丁醇、2-乙基己醇、1-戊醇、1-己醇的相对含量占26.61%，这对南瓜汁的清香风味起着重要的贡献作用，己醛具有清香和果香味，环丁醇、1-戊醇具有醉人的香气。

2.2 发酵南瓜汁的挥发性物质分析

由表1可以看出，经过鼠李糖乳杆菌发酵南瓜汁产生的挥发性成分主要是醛酮类、酸类、醇类、酚类和酯类，共同成分包括2，3-丁二酮、3-羟基-2-丁酮、乙酸、乙醇等29种物质。另外，不同发酵时间南瓜汁挥发性成分分类比较结果如图1所示，发酵时间不同，其挥发性物质在种类和含量上均存在差异。

发酵12 h时，共鉴定出52种挥发性成分，其中，醛酮类物质鉴定出12种，相对峰面积占25.09%；醇类物质9种，相对峰面积占11.13%；酚类物质3种，相对峰面积占10.99%；酯类物质8种，相对峰面积占9.33%；酸类物质7种，相对峰面积占8.2%。其中含量较高的挥发性成分是3-羟基-2-丁酮（16.06%）、2，4-二叔丁基苯酚（8.05%）、乙醇（6.84%）、乙酸（6.31%）、丁二酸二乙酯（5.51%）、2，3-丁二酮（4.42%）、2，4-二叔丁基-6-硝基苯酚（2.54%）。

图1 不同发酵时间南瓜汁挥发性成分比较Fig.1 Comparation of volatile components in different fermentation duration

发酵24 h时，共鉴定出41种挥发性成分，其中，醛酮类15种，相对含量占41.51%；酸类4种，相对含量占12.52%；酯类5种，相对含量占9.81%；醇类5种，相对含量占4.33%，酚类3种，相对含量占2.14%。其主要的挥发性成分为2，3-丁二酮（20.46%）、3-羟基-2-丁酮（10.8%）、乙酸（9.97%）、丁二酸二乙酯（6.17%）、乙醇（2.08%）、丙酮（1.7%）。与发酵12 h相比，醛酮类化合物种类有所增多，且其相对含量显著增加，而醇类和酚类化合物含量明显下降。

发酵36 h时，共鉴定出40种挥发性成分，其中，醛酮类13种，含量为33.16%；酸类4种，含量为16.14%；酯类7种，含量为11.65%；醇类5种，含量为4.7%；酚类3种，含量为4.6%。其中含量较高的挥发性成分是乙酸（13.98%）、2，3-丁二酮（12.35%）、3-羟基-2-丁酮（10.26%）、丁二酸二乙酯（7.59%）、2，4-二叔丁基-6-硝基苯酚（3.15%）、肉桂酸乙酯（2.05%）、乙醇（2.02%）。与发酵24 h相比，酯类和酸类物质含量开始增加，而醛酮类物质含量有所下降。

发酵48 h时，共鉴定出37种挥发性成分，其中，醛酮类13种，占34.44%；酸类4种，占24.5%；酯类5种，

占12.71%；醇类5种，占6.47%；酚类3种，占2.21%。其主要的挥发性成分为乙酸（21.48%）、3-羟基-2-丁酮（14.2%）、2，3-丁二酮（12.3%）、丁二酸二乙酯（7.9%）、乙醇（2.48%）、肉桂酸乙酯（2.24%）、3-甲基-3-丁烯-1-醇（1.99%）。与发酵36 h相比，酯类和酸类含量进一步增加，酚类物质含量显著下降。

2.3 不同发酵时间南瓜汁的挥发性成分比较

2.3.1 醛酮类化合物 醛酮类化合物是发酵南瓜汁的主要风味物质，低级饱和脂肪醛具有强烈的刺激性气味，随着分子量的增加，其刺激性气味减弱，并逐渐出现愉快气味，低级饱和酮往往具有特殊香气，但C15以上的脂肪甲基酮常会带有油脂腐败的臭气［7］。无论是发酵12 h还是发酵24、36、48 h的南瓜汁，其挥发性成分中含量最高的都是醛酮类物质，分别占挥发性化合物总含量的25.09%、41.51%、33.16%、34.44%，其中又以发酵24 h时的最高。经过鼠李糖乳杆菌发酵12 h的南瓜汁中含醛酮类主要是3-羟基-2-丁酮（16.06%），发酵24 h的南瓜汁中含醛酮类主要是2，3-丁二酮（20.46%）、3-羟基-2-丁酮（10.8%），发酵36 h的南瓜汁中含醛酮类主要是2，3-丁二酮（12.35%）、3-羟基-2-丁酮（10.26%），发酵48 h的南瓜汁中含醛酮类主要是3-羟基-2-丁酮（14.2%）、2，3-丁二酮（12.3%），发酵过程中虽然南瓜汁中醛酮类主要物质种类没有发生改变，但是它们的相对含量却一直在变。发酵南瓜汁中酮类物质一部分是以糖类为底物，通过乳酸菌发酵产生的，另有部分来自油酸及亚油酸等脂肪酸的氧化分解，醛类物质来自氨基酸的降解［8-9］，也有研究认为醛类物质的生成与美拉德反应有关［10］。其中，2，3-丁二酮、3-羟基丁酮、壬酮是乳酸菌发酵所特有的挥发性成分，前二者具有清香气味，后者具有新鲜味和土腥味，壬醛具有清香和动物脂味。随着发酵时间的延长，羰基类物质先增加后减少，这可能与鼠李糖乳杆菌在南瓜汁中的代谢活动有关，刚开始时南瓜汁中营养物质丰富，鼠李糖乳杆菌利用南瓜汁的可发酵性糖，快速增长繁殖，将葡萄糖转化为3-羟基-2-丁酮、2，3-丁二酮等一系列风味物质，醛酮类物质快速增加，后来随着发酵的继续，南瓜汁中营养物质逐渐消耗，并伴随着有害代谢物的累积，菌种活动受到抑制，醛酮类物质慢慢减少。

2.3.2 醇和酚类化合物 短碳链的醇类通常具有芳香，碳数较多的饱和醇，其气味逐步减弱以至无嗅感，酚类物质一般具有特殊的芳香气味。发酵南瓜汁中醇类物质先大幅下降后缓慢上升，从11.13%降为4.33%后又升为6.47%，醇类物质的变化与菌种种类以及菌种的胞内酶有关，也与糖类、氨基酸的代谢有关［11］。发酵南瓜汁中酚类物质似乎没有明显的变化规律，但从表1中发现，发酵南瓜汁中酚类主要物质2，4-二叔丁基苯酚的含量发生显著变化，发酵12、24、36、48 h后的南瓜汁中2，4-二叔丁基苯酚相对含量分别占8.05%、1.12%、1.07%、0.45%，从8.05%减少到0.45%。这可能与微生物的生理代谢活动能力有关，从一个环境进入另一个新的培养环境时，刚开始不适应，经过一段时间的调整后，鼠李糖乳杆菌通过改变体内的分子组成包括酶和细胞结构成分，逐渐可以把2，4-二叔丁基苯酚转化成其他物质。

2.3.3 酯类化合物 酯类物质是由醇和酸的酯化作用生成的。酯类物质广泛存在于发酵食品中，挥发性高且阈值通常较低，极易被人的嗅觉感受器所感知，对食品风味的影响起着重要作用。经过发酵后的南瓜汁中酯类物质含量明显增多，且随着发酵时间的延长，酯类含量逐渐上升，从最初的9.33%增长到12.71%，这是由于随着发酵的进行，有机酸含量变多，而酸类易于和醇类结合生成酯，因而酯类物质也随之增加，一些酯类物质的产生也有可能是由于微生物代谢所引起的。其中，丁二酸二乙酯、肉桂酸乙酯是含量最高的两种芳香酯，其阀值较低，对发酵南瓜汁风味的形成起关键作用，赋予发酵南瓜汁果香。

2.3.4 其他类化合物 酸类的产生可以通过乳酸菌的发酵作用产生，也可以通过氨基酸的代谢途径生成。发酵时间越长，发酵南瓜汁中有机酸含量越高，其中主要是乙酸含量增多，发酵48 h乙酸含量增加到21.48%，这可能是鼠李糖乳杆菌在利用南瓜汁中的葡萄糖和果糖等糖类物质发酵过程中，源源不断地产生较多的乙酸及其他有机酸引起的结果。发酵南瓜汁挥发性有机酸主要为乙酸、2-甲基丁酸、2-乙基丁酸，前者表现酸味，后两者表现奶酪味［12］。这些酸类物质的产生使得发酵南瓜汁的风味变得更加丰富。

3 结论

本研究通过顶空固相微萃取（HS-SPME）结合气相色谱-质谱（GC-MS）联用技术，经过鼠李糖乳杆菌发酵南瓜汁后，从发酵12、24、36、48 h的南瓜汁中分别鉴定出52、41、40、37种挥发性物质，四者共有的挥发性成分有29种，鼠李糖乳杆菌发酵南瓜汁中主要挥发性物质为2，3-丁二酮、3-羟基-2-丁酮、乙酸、丁二酸二乙酯、乙醇等物质。发酵12 h时含量较高的挥发性物质主要是3-羟基-2-丁酮（16.06%）、2，4-二叔丁基苯酚（8.05%）、乙醇（6.84%）；发酵24 h时含量较高的挥发性物质主要是2，3-丁二酮（20.46%）、3-羟基-2-丁酮（10.8%）、乙酸（9.97%）；发酵36 h时含量较高的挥发性物质主要是乙酸（13.98%）、2，3-丁二酮（12.35%）、3-羟基-2-丁酮（10.26%）；发酵48 h时含量较高的挥发性物质主要是乙酸（21.48%）、3-羟基-2-丁酮（14.2%）、2，3-丁二酮（12.3%）。发酵时间不同，其挥发性物质在种类和含量上均存在差异，有些物质减少甚至会消失，有些物质增加。通过这些挥发性成分共同的作用分别赋予了四种发酵南瓜汁特有的风味。

［1］周爱梅，曹环，李少华，等.两种不同干燥方法在南瓜粉加工中的对比研究［J］.食品工业科技，2011，32（9）：275.

［2］Adams GG，Imran S，Wang S，et al.The hypoglycaemic effect of pumpkins as anti-diabetic and functional medicines［J］.Food Research International，2011，44（4）：862-867.［3］Kim M Y，Kim E J，Kim Y N，et al.Comparison of the chemical compositions and nutritive values of various pumpkin （Cucurbitaceae）species and parts［J］.Nutrition Research and Practice，2012，6（1）：21-27.

［4］陈金日，冉旭，刘学文.HACCP在南瓜乳酸发酵饮料生产中的应用［J］.中国酿造，2010，214（1）：169-172.

［5］李瑜.新鲜南瓜和南瓜汁挥发性风味物质的成分比较［J］.食品科学，2010，31（2）：208-210.

［6］周春丽，刘伟，李慧，等.混合菌株发酵南瓜汁及其香气分析［J］.现代食品科技，2014，30（5）：301-310.

［7］Verzera A，Dima G，Tripodi G，et al.Fast quantitative determination of aroma volatile constituents in melon fruits by Headspace-Solid-Phase Microextraction and Gas Chromatography-Mass Spectrometry［J］.Food Analytical Methods，2011，4（2）：141-149.

［8］夏延斌，迟玉杰，朱旗.食品风味化学［M］.北京：化学工业出版社，2008.

［9］David J Rowe.Chemistry and Technology of Flavors and Fragrances［M］.USA：CRC Press，2005.

［10］A M Spanier，F Shahidi，T H Parliment，et al.Food Flavor and Chemistry［M］.USA：RSC，2005.

［11］Dragone G，Mussatto S I，Oliveira J M，et al.Characterisation of volatile compounds in an alcoholic beverage produced by whey fermentation［J］.Food Chemistry，2009，112（4）：929-935.

［12］Owen R.Fennema Food Chemistry［M］.3rd Edition.New York，Basel，Hongkong：Marcel Dekker，Inc，1996.

［13］Lee S J，Ahn B.Comparison of volatile components in fermented soybean pastes using simultaneous distillation and extraction（SDE）with sensory characterisation［J］.Food Chemistry，2009，114（2）：600-609.

The change of volatile compounds in fermentation pumpkin juice of Lactobacillus Rhamnose

PENG Xing-xing，LIN Wei-feng，CHEN Zhong*
（College of Light Industry and Food Sciences，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China）

In order to compare the difference of volatile components in Lactobacillus Rhamnose fermentation pumpkin juice with different fermentation duration，the volatile compounds were detected using headspacesolid-phase microextraction（HS-SPME）combined with gas chromatography-mass spectrometry.The results showed that the composition and content of volatiles had some differences with different fermentation duration.52 kinds of volatile components were identified with 12 hours fermentation.The volatile compounds with higher contents included 3-hydroxy-2-butanone（16.06%），2，4-2 tertiary butyl phenol（8.05%）and alcohol（6.84%）.41 kinds of volatile components were identified with 24 hours fermentation.The volatile compounds with higher contents included 2，3-butanedione（20.46%），3-hydroxy-2-butanone（10.8%）and acetic acid（9.97%）.40 kinds of volatile components were identified with 36 hours fermentation.The volatile compounds with higher contents included acetic acid（13.98%），2，3-butanedione（12.35%）and 3-hydroxy 2-butanone（10.26%）.37 kinds of volatile components were identified with 48 hours fermentation.The volatile compounds with higher contents included acetic acid（21.48%），3-hydroxy-2-butanone（14.2%）and 2，3-dione（12.3%）.

fermentation pumpkin juice；headspace-solid-phase microextraction；gas chromatography-mass spectrometry；Lactobacillus Rhamnose；volatile compounds

TS201.1

A

1002-0306（2016）08-0180-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.08.029

2015－10－08

彭兴兴（1990-），男，硕士研究生，研究方向：粮食、油脂及植物蛋白工程，E-mail：wuhuanmin@126.com。

*通讯作者：陈中（1968-），男，副教授，研究方向：食品科学与工程，E-mail：chzhong@scut.edu.cn。