D-半乳糖与牛血清白蛋白相互作用的光谱分析

张怀斌，徐　畅，邢汝月

(滨州医学院药学院，山东 烟台 264003)



D-半乳糖与牛血清白蛋白相互作用的光谱分析

张怀斌，徐畅，邢汝月

(滨州医学院药学院，山东 烟台 264003)

用光谱法研究了D-半乳糖(D-Gal)与牛血清白蛋白(BSA)的相互作用。结果表明，随着D-Gal浓度的增大，BSA的荧光光谱发生猝灭，猝灭机制为静态猝灭，且BSA的最大发射峰蓝移；紫外吸收光谱和同步荧光光谱表明，D-Gal使BSA的疏水性增强，骨架变得松散；热力学分析表明，疏水作用力是D-Gal与BSA间的主要作用力。

D-半乳糖(D-Gal)；牛血清白蛋白(BSA)；光谱分析；疏水作用力

D-半乳糖(D-Gal)又叫氨基半乳糖，是维持体内正常生理活动的营养成分之一，在糖代谢中起重要作用，若过量会导致糖代谢紊乱。而且D-Gal在代谢过程中会产生超氧阴离子自由基，损伤多种生物大分子(如蛋白质、DNA)、改变细胞内基因的表达以及机体的调节系统、降低细胞转录水平[1]，导致肝损伤等[2]。牛血清白蛋白(BSA)是体外实验中重要的模型蛋白[3-5]。作者研究D-Gal与BSA相互作用的光谱变化，以期为D-Gal在药理、药效方面的研究提供参考。

1　实验

1.1试剂与仪器

BSA(纯度>98%)，北京奥博星生物有限公司；D-Gal，北京化工厂；其它试剂均为分析纯。Tris-HCl缓冲溶液0.1mol·L-1(pH=7.40，NaCl浓度0.05mol·L-1)，BSA溶液的浓度为1.0×10-6mol·L-1；D-Gal水溶液的浓度为1.0×10-3mol·L-1。

LS-55型荧光光谱仪，美国PE公司；T1901型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司。

1.2方法

将BSA与不同浓度的D-Gal均匀混合，以285nm的光作为激发光，调节激发和发射狭缝宽度比为6∶8，在不同温度下测定BSA的荧光光谱；在190～300nm范围测定BSA的紫外吸收光谱。

2　结果与讨论

2.1D-Gal与BSA相互作用的荧光光谱

BSA的荧光主要来源于色氨酸残基[6]，通过BSA荧光光谱的变化可以判断药物小分子对BSA结构的影响和色氨酸残基周围疏水腔环境的微变化[4]。不同浓度的D-Gal对BSA的荧光猝灭光谱见图1。

1～7，D-Gal浓度(×10-6 mol·L-1)：0,3.3,6.6,9.9,13.2,16.5,19.8

由图1可知，BSA的最大发射峰位于350 nm处，随着D-Gal浓度的增大，BSA的荧光强度不断减弱，最大发射峰蓝移了4 nm。表明D-Gal对BSA的荧光具有猝灭作用。

2.2D-Gal与BSA相互作用的猝灭机制

荧光猝灭机制分为动态猝灭和静态猝灭两类，猝灭机制可以通过Stern-Volmer方程F0/F=1+KSVc=1+Kqτ0c来判断[3](式中：F、F0分别为有、无猝灭剂时的荧光强度；KSV为Stern-Volmer动态猝灭常数；c为猝灭剂浓度；Kq为双分子猝灭过程速率常数；τ0为生物大分子的平均荧光寿命，为10-8s)。

图2为不同温度下D-Gal与BSA相互作用的Stern-Volmer曲线，根据直线斜率求出KSV，进一步求出Kq，结果见表1。

图2　D-Gal与BSA相互作用的Stern-Volmer曲线

表1D-Gal与BSA相互作用的猝灭常数及猝灭速率常数

Tab.1　Quenching constant(KSV) and quenching rate constant(Kq) of the interaction between D-Gal and BSA

由表1可知，Kq远大于动态猝灭的最大扩散速率常数2.0×1010L·mol-1·s-1，初步推断D-Gal对BSA的荧光猝灭机制为静态猝灭[4-7]。随着温度的升高，二者作用的斜率略有增大，说明动态猝灭在整个荧光猝灭过程中贡献微弱。

BSA的猝灭机制还可以通过BSA紫外吸收光谱的变化来判断，静态猝灭时BSA的紫外吸收光谱会发生改变；动态猝灭不会发生变化[5]。图3为不同浓度的D-Gal与BSA相互作用的紫外吸收光谱。

1～3，D-Gal浓度(μmol·L-1)：0,6.6,13.2

由图3可知，210 nm附近的吸收峰为BSA骨架的吸收峰，280 nm附近的吸收峰是色氨酸、酪氨酸残基的吸收峰[8]。由图3插图可知，随着D-Gal浓度的增大，280 nm附近的吸收峰强度略微减弱，且发生红移，说明在BSA中加入D-Gal后，二者发生了相互作用，改变了BSA发色团周围的微环境；随着D-Gal浓度的增大，210 nm附近的吸收峰强度明显减弱，并发生红移，说明BSA的骨架变得松散[3]。这是因为，D-Gal与BSA生成了基态复合物，改变了BSA的吸收光谱。因此，推断D-Gal对BSA的猝灭机制为静态猝灭。

2.3D-Gal与BSA相互作用的同步荧光光谱(图4)

以285 nm为激发光，当△λ=60 nm时会显示出色氨酸(Trp)残基的荧光特性[7]。从图4可以看出，随着D-Gal浓度的增大，色氨酸残基的荧光强度逐渐减弱，最大发射峰略有红移；△λ=15 nm时显示酪氨酸(Tyr)残基的荧光特性，本实验条件下，酪氨酸残基的最大发射峰的位置和荧光强度没有明显变化(图略)。说明在激发光波长为285 nm时BSA的荧光主要由色氨酸残基贡献，在D-Gal作用下色氨酸残基所处的微环境的极性发生了改变，疏水性增强，从而使得BSA的荧光光谱发生了变化[7]。

1～7，D-Gal浓度(μmol·L-1)：0,3.3,6.6,9.9,13.2,16.5,19.8;△λ=60 nm

2.4D-Gal与BSA相互作用的热力学参数

药物小分子与蛋白质之间的相互作用符合方程[9]：lg(F0/F-1)=lgKA+nlgc，以lg(F0/F-1) 对lgc作图(图5)，可求出D-Gal与BSA的结合常数KA及结合位点数n，结果见表2。

图5　lg(F0/F-1)与lgc的关系曲线

表2不同温度下，D-Gal与BSA相互作用的热力学参数

Tab.2　Thermodynamic parameters of interaction between D-Gal and BSA at different temperatures

Ross等[10]研究表明，△H和△S均为正值时，相互之间的作用力主要为疏水作用力；△G小于零，说明二者之间的结合可自发进行；△H大于零，表明该结合作用为吸热过程，升高温度，结合作用增强。从表2可知，△H和△S均为正值，表明D-Gal与BSA之间的主要作用力是疏水作用力。

3　结论

采用光谱法研究了D-Gal与BSA的相互作用。结果表明，D-Gal与BSA可以形成基态复合物猝灭BSA的内源荧光，疏水作用力是其主要作用力，D-Gal能改变BSA色氨酸残基的微环境。

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Spectra Analysis of Interaction Between D-Galactose and Bovine Serum Albumin

ZHANG Huai-bin,XU Chang,XING Ru-yue

(SchoolofPharmacy,BinzhouMedicalUniversity,Yantai264003,China)

TheinteractionbetweenD-galactose(D-Gal)andbovineserumalbumin(BSA)wasinvestigatedbyaspectraanalysis.Resultsindicatedthat,thefluorescencespectrumofBSAwasquenchedwiththeincreasingofD-Galconcentration,andthequenchingprocesswasastaticmechanism.ThemaximumemissionpeakofBSAemergedablueshift.TheultravioletabsorptionspectrumandsynchronousfluorescencespectrumindicatedthatD-GalloosenedtheskeletonofBSAandimprovedthehydrophobicityofBSA.ThethermodynamicanalysisindicatedthatthemainactingforceofinteractionbetweenD-GalandBSAwashydrophobicforce.

D-galactose(D-Gal);bovineserumalbumin(BSA);spectrumanalysis;hydrophobicforce

10.3969/j.issn.1672-5425.2016.08.016

山东省医药卫生科技计划资助项目(2015WS0495)，山东省高等学校科技计划资助项目(J12LD550)，滨州医学院大学生科技创新项目(BY2014DKCX092，BY2015DKCX025)

2016-03-22

张怀斌(1978-)，男，山东青州人，讲师，研究方向：生物分析化学，E-mail：zhanghuaibinhua@163.com。

O 657.3

A

1672-5425(2016)08-0067-03

张怀斌，徐畅，邢汝月.D-半乳糖与牛血清白蛋白相互作用的光谱分析[J].化学与生物工程，2016，33(8)：67-69.