超声辅助异丙醇/（NH4）2SO4双水相体系提取金银花中总黄酮

程志发，马 燮，毛华剑（四川理工学院材料与化学工程学院，四川 自贡 643033）

研究与开发

超声辅助异丙醇/（NH4）2SO4双水相体系提取金银花中总黄酮

程志发，马 燮，毛华剑
（四川理工学院材料与化学工程学院，四川 自贡 643033）

采用异丙醇/硫酸铵/水构建双水相体系，研究在超声波作用下操作条件对金银花中总黄酮萃取效果的影响。实验结果表明，金银花总黄酮主要分布在上相，双水相体系的组成（异丙醇与硫酸铵的浓度）对萃取效果的影响较大。当异丙醇质量分数为30%、硫酸铵质量分数为25%时，常温下超声处理20min，分配系数为29.4，总黄酮的萃取率为94.8%。

金银花；双水相；总黄酮；超声辅助

金银花是忍冬科忍冬属植物，性甘寒，气味芳香，具有清热解毒，抗菌消炎的功效，研究表明，从金银花即叶中提取得到的黄酮类化合物具有抗菌、抗氧化、降压、降血脂等活性，在医药、食品等领域具有良好的应用前景［1-2］。双水相萃取（ATPS）是通过溶质在两水相间分配系数的差异而进行萃取的技术，因其操作条件温和，现已被广泛应用于生物活性物质的分离纯化中，并取得了良好的效果［3-5］。双水相萃取技术与其他技术的集成也成为双水相技术的一个重要发展方向。研究表明，在萃取过程中引入超声技术，利用超声振荡产生的空化效应等多重效应，可以加速目标成分进入溶剂，促进提取过程的进行［6］。胡松青等［7］研究了超声波对聚乙二醇（PEG）/磷酸盐双水相系统组成及牛血清蛋白（BSA）在其中分配的变化规律，实验结果表明，超声波作用增大了分配系数。本文将超声辅助异丙醇/（NH4）2SO4双水相萃取用于从金银花中提取总黄酮，研究各因素对提取效果的影响，为相关的开发研究工作提供理论依据。

1　材料与方法

1.1试剂与仪器

金银花（外购），80℃烘干，粉碎，过0.175mm筛备用。对照品芦丁（外购），异丙醇、硫酸铵、硝酸铝、氢氧化钠、亚硝酸钠均为分析纯，实验用水为实验室自制去离子水。

UV-1100 PC 型紫外分光光度计，SC-3612低速离心机，SM-5200DTD型超声波清洗机，CP114型电子天平，烘箱等。

1.2实验方法

1.2.1总黄酮含量的测定方法

总黄酮含量的测定方法参考文献［8］，以芦丁为对照品，采用分光光度法，在510nm处进行测定。

称取芦丁标准品13.60mg，转移并定容至50mL容量瓶中，即得浓度为0.272mg·mL-1的芦丁标准品溶液。分别取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL 的芦丁标准溶液置于25mL的比色管中，用无水乙醇稀释至10.0mL，加入1.0mL质量分数5%的亚硝酸钠溶液，静置6min，加入1.0mL质量分数10 %的硝酸铝溶液，静置6min，加入4.0mL的10% 氢氧化钠溶液，定容至刻度。静置10min，于510nm处测吸光度。以吸光度Y为纵坐标，芦丁浓度X为横坐标建立标准曲线，得过原点线性回归方程为：Y=10.408X，R2=0.9984。

1.2.2超声波辅助双水相萃取提取金银花中总黄酮

双水相体系总质量设计为40g，于 50mL具塞试管中，加入一定量的异丙醇和硫酸铵，不足部分以水补充，然后将一定量的金银花粉末加入双水相体系中，混匀，静置10min，放进超声波清洗机中，在一定的功率、温度下，超声处理一定时间，过滤，滤液静置分层，待体系分相完全，读取上下相体积，分别取上、下相溶液按1.2.1中方法分析总黄酮含量，分配系数K按式（1）计算，提取率Y按式（2）计算。

式中：Vt和Vb分别代表上相和下相的体积，L；Ct和Cb分别代表总黄酮在上相和下相的浓度，g·L-1。

2　结果与讨论

2.1双水相体系组成（异丙醇/硫酸铵含量）对总黄酮萃取效果的影响

［9］，当异丙醇含量固定20%时，硫酸铵的含量要高于15%才能形成双水相，而且异丙醇含量越高，形成双水相时对盐的浓度要求越低，同时，当异丙醇含量为20%，硫酸铵浓度超过33%就会有盐析出，且异丙醇浓度越高，析出盐时对应的硫酸铵浓度越低，因此，实验主要考察异丙醇质量分率固定在20%、25%、30%的条件下，硫酸铵用量对体系分配系数及总黄酮萃取率的影响。

双水相体系总质量设计为40g，于具塞试管中加入一定量的异丙醇使其质量分数一定，改变硫酸铵的质量分数，静置10min，超声处理15min，实验结果见图1和图2。

图1　硫酸铵用量对分配系数的影响

图2　硫酸铵用量对萃取率的影响

双水相的形成是（NH4）2SO4与异丙醇争夺水分子的过程，由图1和图2可知，随着硫酸铵用量的增加，下相对水的缔合能力增强，下相的体积增加，因此，硫酸铵用量的改变可影响到上相的极性，从而影响到总黄酮的分配。随着硫酸铵用量增加，分配系数和总黄酮提取率均增加，但当（NH4）2SO4用量增大到一定程度后，下相开始有少量盐析出，且异丙醇浓度越高，析出盐时硫酸铵的浓度越低。从图1和图2中还可以看出，随着异丙醇质量分数的增加，总黄酮在富含异丙醇的上相中有较大的分配系数，当异丙醇浓度为30%，硫酸铵含量超过22.5%以后，分配系数变化不大，且硫酸铵含量超过30%以后，实验中发现下相中开始有少量盐析出。由图1和图2可知，在实验范围内，异丙醇浓度为30%，硫酸铵浓度为25%时，总黄酮萃取率达到93.8%，分配系数为27.9。

2.2超声时间对提取效果的影响

双水相体系总质量设计为40g，异丙醇质量分数为30%，硫酸铵质量分数25%的条件下，静置10min，搅拌使其分相，放进超声波清洗机中，改变时间分别为15、20、25、30、35min，超声提取，结果见图3。

图3　超声时间对金银花中总黄酮萃取效果的影响

从图3中可看出，在实验范围内，萃取时间对萃取率的影响不大，分配系数K在20min处达到最大值29.4，萃取率R为94.8%。

3　结论

将超声提取与双水相分离技术集成，用于提取金银花中的总黄酮，实验结果表明，金银花总黄酮主要分配在上相，异丙醇与硫酸铵的浓度对萃取效果的影响较大。当异丙醇质量分数为30%、硫酸铵质量分数为25%时，室温下超声处理20min，分配系数为29.4，总黄酮的萃取率为94.8%。

参考文献：

［1］ 武雪芬，白雁.金银花叶药用成分的提取及抑菌试验研究［J］.中成药，2001，23（6）：448-449.

［2］ 胡志军，沈玲玲，王南溪，等.大孔吸附树脂分离纯化金银花中黄酮类物质的研究［J］.离子交换与吸附，2011，27（3）：229-237.

［3］ 周春晖，李俊.β-环糊精辅助提取金银花中总黄酮的工艺研究［J］.中成药，2010，32（10）：1796-1799.

［4］ 许灵君，欧阳玉祝，吴道宏，等.双水相体系协同超声提取法分离金银花总黄酮［J］.食品与发酵科技，2010，46（6）：93-96.

［5］ Liu Yu，Han Juan， Wang Yun， et al. Selective separation of flavones and sugars from honeysuckle by alcohol/salt aquerous two-phase system and optimization of extraction process［J］.separation and purification technology， 2013（118）：776-783.

［6］ 银永忠，龙进国.响应面法优化黄柏总黄酮的双水相超声提取工艺［J］.食品与发酵科技，2011，47（6）：65-69.

［7］ 胡松青，赵玮.超声波对PEG/磷酸盐双水相系统组成及BSA分配的影响［J］.应用声学，2010，29（3）：236-240.

［8］ 袁珂， 薛月芹，楼炉焕.竹叶总黄酮不同提取方法的比较研究［J］.林产化学与工业，2007，27（6）：109-112.

［9］ 王赟.水溶性小分子醇-盐双水相体系的构建及分相/分离机制和应用研究［D］.镇江：江苏大学，2010.

Extraction of Total Flavonoids from Honeysuckle with Isopropano/ Ammonium Sulfate Aqueous Two-phase System by Ultrasonic-assisted

CHENG Zhi-fa， MA Xie， MAO Hua-jian （College of Materials and Chemical Engineering， Sichuan University of Science and Engineering， Zigong 643000， China）

Aqueous two-phase system was constructed with alcohols / ammonium sulfate / water. The extraction operating conditions of total flavonoids from honeysuckle by ultrasonic-assisted were investigated. The experiments results showed that the total flavnoids mostly accumulated in the top phase.It was found that the concentration of isopropanol and ammonium sulfate had greater effect on aqueous two-phase extraction. The appropriate conditions were as followed： the quality percentage of isopropanol was 30% and the quality percentage of ammonium sulfate was 25%， ultrasonic treat time was 20 min. Under these conditions， the distribution coefficient K was 29.4 and the extraction ratio was 94.8%，

honeysuckle； aqueous two-phase system； total flavonoids； ultrasonic-assited

O 623.54

A

1671-9905（2016）08-0001-03

精细化工助剂及表面活性剂四川省高校重点实验室项目（2013JXZ01）；四川省教育厅资助项目（11ZA119）

通讯联系人：马燮，E-mail：maxie@suse.edu.cn

2016-05-25