青荚叶多酚超声波辅助提取工艺及抗氧化活性研究

孙志武,李　宁,李　好,李红萍,*

(1.郑州大学公共卫生学院,河南郑州 450001;2.郑州大学化工与能源学院,河南郑州 450001)



青荚叶多酚超声波辅助提取工艺及抗氧化活性研究

孙志武1,李宁2,李好1,李红萍2,*

(1.郑州大学公共卫生学院,河南郑州 450001;2.郑州大学化工与能源学院,河南郑州 450001)

确定超声波辅助提取青荚叶多酚的最佳工艺条件及其体外抗氧化活性。在单因素实验的基础上,固定超声功率65 W,提取次数2次,通过响应面法优化设计提取多酚的工艺参数,并对其抗氧化活性进行测定分析。结果表明:超声辅助提取青荚叶多酚的最佳工艺参数为乙醇体积分数40.8%、提取时间4.8 min、料液比1∶60 (g∶mL)、提取温度67.5 ℃,多酚提取量为29.43 mg/g。青荚叶多酚具有较强的还原能力,清除DPPH自由基和ABTS+·自由基IC50分别为44.28、35.07 mg/L。因此,青荚叶可作为潜在天然抗氧化剂应用于食品和医药工业中。

青荚叶,多酚,超声辅助,响应面法,抗氧化

青荚叶(HeLwingiajaponica)为山茱萸科青荚叶属落叶灌木,因雌花无梗,生于叶脉中部而得名,主要分布于亚洲东部和东南部的一些国家和地区。在《植物名实图考》中,青荚叶又称为阴证药、大部参,植株各部位均可入药,具有活血消肿、清热解毒等功效[1]。青荚叶富含人体必需的氨基酸、不饱和脂肪酸、多糖、多酚类等生物活性成分,是一种药食同源的新资源食品[2],且在食品、医药、化工等行业也有广泛的用途,是极其宝贵的自然资源。多酚是重要的植物次级代谢产物,大量研究结果表明,植物多酚能显著的清除人体内自由基,具有抗氧化、抗心血管疾病、抗菌和抗癌等生物学功效[3-4]。近年来,以植物多酚为原料的营养和保健食品需求量日益增多。青荚叶作为一种药食同源的新资源食品,目前对其的研究主要集中在观赏和种植、药用价值、化学成分及多糖提取等方面,对青荚叶中具有营养和保健功能的多酚类物质的研究鲜有报道。超声辅助提取天然产物活性成分分离技术,利用超声产生的空化效应加速原料细胞壁的破碎,增加溶剂的穿透力,从而加速细胞内物质的溶出、释放和扩散,具有操作简单、提取效率高、节省溶剂等特点[5-7],近年来已逐渐被应用到天然植物活性成分的提取。本实验采用响应面分析法优化超声辅助提取青荚叶多酚(HelwingiajaponicaPolyphenols,以下简写为HLJP)的提取工艺,并对HLJP的体外抗氧化活性进行测定分析,为青荚叶资源的开发利用提供一定的理论基础。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

青荚叶新鲜野生,2013年6月采自河南省伏牛山脉卢氏县狮子坪原始森林;正己烷、没食子酸、无水乙醇、盐酸、无水碳酸钠、福林试剂、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、过硫酸钾、铁氰化钾、三氯乙酸、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾等试剂均为国产分析纯级,所用水均为二次蒸馏水。

UV-1750紫外可见分光光度计岛津国际贸易(上海)有限公司;BILON-650CT多用途超声波提取机上海比朗仪器有限公司;BILON-W-530B低温恒温槽北京比朗实验设备有限公司;RE-52AA旋转蒸发仪巩义予华设备有限责任公司;TG-16高速离心机巩义科华设备有限责任公司;PHS-3C酸度计上海雷磁仪器厂。

1.2实验方法

1.2.1HLJP提取工艺流程青荚叶→清洗→低温干燥→粉碎→索氏提取法(正己烷为溶剂)脱脂→低温真空干燥→超声(65 W)辅助浸提→6000 r/min离心30 min取上清液→旋转蒸发浓缩→定容→测定吸光度→计算HLJP提取量。

1.2.2多酚含量的测定采用福林酚法[8]进行测定,以没食子酸溶液为标准,根据吸光值与没食子酸浓度建立回归方程为Y=0.0896X+0.0221(Y:吸光值;X:没食子酸溶液浓度;R2=0.9985)。多酚提取量按公式(1)计算:

式(1)

式中:C为HLJP质量浓度(mg/mL);V为HLJP提取液体积(mL);m为青荚叶样品质量(g)。

1.2.3HLJP提取工艺优化根据已做的超声辅助提取HLJP单因素实验结果,选择乙醇体积分数、超声时间、料液比和提取温度,进行四因素三水平的Box-Behnken中心组合实验设计,所取各因素及水平见表1。以HLJP提取量为响应值,通过响应面法优化提取工艺条件。

1.2.4HLJP对Fe3+还原能力测定配制不同浓度梯度的样品溶液(50、100、150、200、250、300 mg/L),依次在比色管中加入样品1.00 mL、磷酸盐缓冲溶液(pH6.6)1.0 mL、铁氰化钾溶液(1%)1.0 mL,混匀,50 ℃恒温水浴30 min,取出冷却至室温,加入1.0 mL三氯乙酸溶液(10%),混匀,4000 r/min离心20 min,移取1.00 mL上清液至另一具塞试管中,加入2.0 mL水和1.0 mL三氯化铁溶液(0.1%),摇匀后室温静置10 min,测定液体在波长700 nm处的吸光度,以维生素C(50、100、150、200、250、300 mg/L)做标准对照品[9-10]。

表1　Box-Behnken中心组合因素水平表Table 1　Factors and levels of Box-Behnken central composite experimental design

1.2.5DPPH·清除能力的测定配制不同浓度梯度的样品溶液(5、25、50、75、100、125 mg/L),依次在10 mL的比色管中加入样品2.00 mL,磷酸盐缓冲溶液(pH 6.88)4.0 mL,0.1 mmol/L DPPH·溶液2 mL,摇匀,避光反应30 min,以95%的乙醇溶液作参比,在517 nm处测定溶液的吸光度[11],以维生素C(5、25、50、75、100、125 mg/L)做标准对照品,无水乙醇做空白对照。自由基清除率计算公式为(2):

式(2)

式中:Y为DPPH·清除率,A0为空白对照溶液吸光度,AS为样品溶液吸光度,AS0为未加DPPH·溶液的本底吸光度。

1.2.6ABTS+·清除率测定将7 mmol/L ABTS溶液5 mL和140 mmol/L过硫酸钾溶液88 μL混合产生ABTS+·,室温下避光静置反应12～16 h,即得到ABTS+·溶液。使用时用水稀释ABTS+·溶液定容至500 mL,使其在734 nm处的吸光度为0.700±0.02[12]。依次在10 mL的比色管中加入0.50 mL不同浓度梯度的样品溶液(5、15、25、50、60、65 mg/L)、5.5 mL的ABTS+·溶液,混匀,在37 ℃水浴中保温20 min,测定其在734 nm处吸光度,以维生素C(以下简称VC)(5、15、25、50、60、65、70、75 mg/L)做标准对照品。以纯水做为空白对照。样品抗氧化能力以其对ABTS+·的清除率Y来表示,计算公式同式(2)。式中:Y为ABTS+·清除率,A0为空白对照溶液吸光度,AS为样品溶液吸光度,AS0为未加ABTS+·溶液的本底吸光度。

1.2.7数据处理运用Design-Expert.V8.0.6.1和origin9.0软件对实验结果分析并作图。

2　结果与分析

2.1响应面法优化青荚叶提取工艺

在单因素实验基础上,选择4个对HLJP提取量影响较为显著的因素(X1为乙醇体积分数,X2为超声时间,X3为料液比,X4为提取温度),依据Box-Behnken 中心组合设计原理,进行4因素3水平的中心组合设计,实验设计及结果见表2。

表2　Box-Behnken 中心组合实验设计及结果Table 2　Box-Behnken central composite experimental design and the results

运用Design-Expert.V8.0.6.1软件对表2中数据拟合,得到多酚提取量的二次多元回归模型方程为:

回归方程的方差分析结果见表3,回归模型p<0.0001,模型极其显著。失拟项p=0.3603>0.05,失拟不显著。用该模型分析、预测超声辅助提取HLJP的结果见表2。模型中,除X2、X1X3、X1X4、X2X4、X3X4外,其他项p<0.05,表明这些项对HLJP提取量的影响均达到显著水平。

根据回归方程所绘制的响应曲面见图1,依据曲面的陡峭程度,可判断料液比X3、乙醇体积分数X1、提取温度X4对HLJP提取量影响均较为显著。结合表3数据,可知X1X2、X2X3的交互作用对HLJP提取量的影响显著,X1X4、X3X4、X2X4、X1X3的交互作用对HLJP提取量的影响不显著,比较各因素F值大小,判断各因素对HLJP提取量影响的顺序为:料液比X3>乙醇体积分数X1>提取温度X4>超声时间X2。

表3　回归方程的方差分析结果Table 3　Analysis of variance for regression equation

注:* 差异显著,p<0.05;** 差异极显著,p<0.01。

图1　各因素的交互作用对HLJP提取量影响的响应曲面Fig.1　Response surface of different factors on HLJP yield

通过Design-Expert.V8.0.6.1软件分析,HLJP提取最佳工艺条件是:乙醇体积分数40.8%,提取时间4.8 min,料液比1∶60 g∶mL,提取温度67.5 ℃,在此条件下,HLJP的预测提取量为29.58 mg/g,五组平行验证实验所得的HLJP平均提取量为29.43 mg/g,预测值和验证值误差在±1%以内,由此可知,响应面分析法优化提取条件可靠。

2.2HLJP的抗氧化性分析

2.2.1HLJP对Fe3+还原能力测定在还原能力分析中,反应产物在700 nm波长处的吸光度越大,样品的还原能力越大[13]。实验结果见图2,随着浓度的增大,HLJP和VC对Fe3+还原能力逐渐增强,存在明显的量效关系。比较相同浓度下的吸光度可知,HLJP的还原能力强于维生素C。

图2　HLJP对Fe3+的还原能力Fig.2　The reducing power of HLJP to Fe3+

2.2.2HLJP对DPPH·清除率测定通过测定物质对DPPH·的清除能力,可以快速的评价物质的抗氧化性[14-15]。实验结果见图3,随着溶液浓度的增大,HLJP和维生素C对DPPH·清除能力逐渐增强。当清除剂浓度达到80 mg/L时,HLJP和VC对DPPH·的清除率增速变缓。较高浓度时,HLJP对DPPH·清除能力要明显强于VC。HLJP和VC的IC50分别为44.28、65.09 mg·L-1。

图3　HLJP对DPPH·的清除率Fig.3　Scavenging rate of HLJP on DPPH· free radicals

2.2.3HLJP对ABTS+·清除率的测定HLJP和VC对ABTS+·清除率见图4。在5～65 mg·L-1的浓度范围内,ABTS+·清除率随着清除剂浓度的增加逐渐增强,存在良好的量效关系。在浓度为65 mg·L-1时,HLJP和VC对ABTS+·清除率分别可达到100%、87.39%。比较相同浓度下的清除率可知,HLJP对ABTS+·清除能力强于VC。HLJP和VC的IC50分别为35.07、44.17 mg·L-1。

图4　HLJP对ABTS+·清除作用Fig.4　Scavenging rate of HLJP on ABTS+· free radicals

3　结论

在植物有效成分的提取中,由于超声波独特的机械效应、空化效应及热效应,越来越受到学者的重视。本文利用响应面法对超声辅助提取HLJP的工艺参数进行优化实验设计,影响提取得率的因素依次为:料液比>乙醇体积分数>提取温度>提取时间,优化后的最佳提取工艺条件为乙醇体积分数40.8%、提取时间4.8 min、料液比1∶60 g∶mL、提取温度67.5 ℃。在此工艺条件下,HLJP的提取量为29.43 mg/g。HLJP对Fe3+的还原能力、清除DPPH·和ABTS+·的能力均强于VC,说明青荚叶多酚具有较强的抗氧化能力。因此,青荚叶可以作为抗氧化的功能性食品,有进一步开发利用的价值。

[1]陈琳,李文婧,姚默,等. 青荚叶属药学研究概况[J]. 辽宁中医药大学学报,2012(9):116-118.

[2]孙志武,王猛,李红萍,等. 青荚叶营养成分评价分析[J].食品科技,2014(10):96-100.

[3]Lee J H,Papk K H,Lee M H,et al. Identification,characterisation,and quantification of phenolic compounds in the antioxidant activity-containing fraction from the seeds of Korean perilla(Perilla frutescens)cultivars[J]. Food Chemistry,2013,136:843-852.

[4]Pasinett G M,Wang Jun,Zhao Wei,et al. Roles of Resveratrol and Other Grape-Derived Polyphenols in Alzheimer’s Disease Prevention and Treatment[J]. BBA-Molecular Basis of Disease,2015,1852:1202-1208.

[5]Chemat F,Huma E Z,Muhammed K K. Applications of ultrasound in food technology:Processing,preservation and extraction[J]. Ultrasonics-Sonochemistry,2010,18(4):813-835.

[6]Xia Yong gang,Yang Bing you,Ling Jun,et al. Optimization of simultaneous ultrasonic-assisted extraction of water-soluble and fat-soluble characteristic constituents from Forsythiae Fructus Using response surface methodology and high-performance liquid chromatography[J]. Pharmacogn Mag,2014,10(39):292-303.

[7]刘亚敏,刘玉民,李琼,等. 超声波辅助提取山银花绿原酸工艺及其抗氧化性研究[J]. 食品工业科技,2014,(1):186-190,195.

[8]Liu J,Jia L,Kan J,et al.Invitroandinvivoantioxidant activity of ethanolic extract of white button mushroom(Agaricus bisporus)[J]. Food and Chemical Toxicology,2013,51:310-316.

[9]李昌勤,卢引,尹震花,等. 6种南瓜栽培品种体外抗氧化活性研究[J]. 食品工业科技,2012,(15):90-92

[10]马虎飞,王思敏,杨章民. 陕北野生枸杞多糖的体外抗氧化活性[J]. 食品科学,2011(3):60-63.

[11]Sarikurkcu C,Tepe B,Semiz D K,et al. Evaluation of metal concentration and antioxidant activity of three edible mushrooms from Mugla,Turkey[J]. Food Chem Toxicol,2010,48(5):1230-1233.

[12]闫永芳,孙钧,孟天真,等. 枇杷花提取物抗氧化活性研究[J]. 食品工业科技,2012,33(1):122-124.

[13]王华,黄宜兵,高科翔. 酶解鹿茸肽的制备、纯化及抗氧化活性[J]. 高等学校化学学报,2010(12):2390-2395.

[14]Ghasemzadeh A,Omidvar V,Jaafar H Z.E. Polyphenolic content and their antioxidant activity in leaf extract of sweet potato(Ipomoea batatas)[J]. Journal of Medicinal Plant Research,2012,6(15):2971-2976.

[15]陈荫,郭守东,徐健,等. 海绵内生真菌胞外多糖理化性质及自由基清除活性研究[J]. 中国海洋大学学报(自然科学版),2010(05):1-4,106.

Study on the ultrasound-assisted extraction and antioxidant capacity of Polyphenols fromHelwingiaJaponica

SUN Zhi-wu1,LI Ning2,LI Hao1,LI Hong-ping2,*

(1.College of public health,Zhengzhou University,Zhengzhou 450001,China;2.School of Chemical Engineering and Energy,Zhengzhou University,Zhengzhou 450001,China)

The research aimed to determine the optimal ultrasonic-assisted extraction process ofHelwingiajaponicahelwpolyphenols and its antioxidant activityinvitro. On the basis of design and analysis of single-factor experiments,through which the optimal ultrasonic power and the frequency of extraction were found to be 65 W and two times,the technological conditions of ultrasonic-assisted for theHelwingiajaponicapolyphenols were optimized by response surface methodology and the antioxidant activity ofHelwingiajaponicapolyphenols was also studied by DPPH· and ABTS+·. The result showed that the optimum extraction conditions ofHelwingiajaponicapolyphenols were the volume fraction of 40.8% ethanol,ultrasonic time 4.8 min,solid-liquid ratio 1∶60(g∶mL),extraction temperature 67.5 ℃. Under this condition,the yield of polyphenols obtained was 29.43 mg/g. The tests of antioxidant capacity showed thatHelwingiajaponicapolyphenols had strong deoxidizing ability,and the IC50of DPPH· and ABTS+· were 44.28 mg/L and 35.07 mg/L respectively. Therefore,Helwingiajaponicahas a good potential as a natural antioxidant used in food or medicine industries.

Helwingiajaponica;polyphenols;ultrasound-assisted;response surface methodology;antioxidant activity

2015-05-15

孙志武(1989-)，男，硕士，研究方向：公共卫生，E-mail:sunzhiwuyf@163.com。

李红萍(1967-)，女，博士，教授，研究方向：绿色化工，E-mail:lhpdgw@zzu.edu.cn。

河南省教育厅科技攻关项目(13A330459)。

TS255.1

B

1002-0306(2016)03-0261-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.046