CCD响应面设计优化米曲霉产果糖基转移酶的发酵工艺

王　鹏,蒋　波,王圣海,范　森,林晓珊,张　毅

(华南理工大学生物科学与工程学院,广东广州 510006)



CCD响应面设计优化米曲霉产果糖基转移酶的发酵工艺

王鹏,蒋波,王圣海,范森,林晓珊,张毅*

(华南理工大学生物科学与工程学院,广东广州 510006)

本文用蔗糖、豆粕粉、玉米粉作为基础培养基,对产果糖基转移酶的米曲霉诱变融合菌株RⅢ-7进行发酵实验,通过Plackett-Burman优化实验,得到影响其发酵的3个显著因素,分别为蔗糖浓度、豆粕粉浓度、转速;再通过中心复合设计(CCD)响应面设计进一步优化米曲霉产果糖基转移酶的发酵工艺,实验结果表明,蔗糖、豆粕粉和转速之间存在着交互作用,其中豆粕粉浓度与转速之间的交互作用显著,得到最优工艺参数为:蔗糖浓度为5.95%、豆粕粉浓度为1.60%、转速为165 r/min。经验证,在最优发酵工艺条件下,米曲霉产果糖基转移酶酶活力达到870.21 U/g,与预测值895.68 U/g接近,误差为0.028%。

米曲霉,果糖基转移酶,Plackett-Burman 优化,响应面设计,发酵

低聚糖一般是由3～10个单糖通过糖苷键连接起来的新型功能性糖。蔗果低聚糖(Fructo-oligosacchrides,FOS)又名低聚果糖或寡果糖,是新型低聚糖的一种,以蔗糖为底物,经过果糖基转移酶(Frucosyltransferase)的作用,在蔗糖的果糖残基C1和C2位置以β-1,2-糖苷键连接1～3个果糖分子形成的低聚糖[1]。低聚果糖不仅能增加肠内有益菌的生长,有效抑制有害菌的繁殖,提高免疫力,延缓衰老[2],还能改善脂质代谢、降低血脂和胆固醇、促进矿物质的吸收、利于维生素合成等[3]。目前,FOS的商品化生产主要是以高浓度的蔗糖作底物利用微生物产生的具有转果糖基活力的酶转化而来[4]。能产生果糖基转移酶的微生物有曲霉Aspergillussp.、节杆菌Arthrobactersp.、枯草杆菌Bacillussubtilis、酵母Zymomonasmobilis、链孢霉Fusariumsp.等[5-7]。而米曲霉(Aspergillusoryzae)由于菌落生产快,基本无毒性,常作为发酵食品的生产菌株。米曲霉是一种好气性真菌,属于半知菌亚门曲霉属。米曲霉菌丝是由多细胞组成,菌丝一般呈黄白色、黄绿色、黄褐色。1943年,Hestrin 等使用菌株Aerobacterlevanicum(NCIB 9966)生产果聚糖,并详细研究了该菌株的产果糖基转移酶的催化机理及其转移性[8]。Muramatsu等在1988年筛选到一株产果糖基转移酶菌株的曲霉AspergillussydowiIAM2544,并研究了产物低聚果糖的化学结构[9]。Balken研究小组在1991年从曲霉phoenicisCBS294.80的发酵液中提取出β-呋喃果糖苷酶,该酶的酶活力在60 ℃时达到最高,将其生产FOS时,产率达到60%。近年来,通过固定化果糖基转移酶商品化生产FOS,因有诸如酶能反复利用、避免菌体细胞污染、可免去脱色、除盐工序等优点成为了研究和开发的热点[10-11]。响应面分析法是采用多元二次回归方法作为函数估计的工具,将多因子实验中因素与指标的相互关系用多项式近似拟合,依此可对函数的响应面和等高线进行分析,研究因子与响应面之间、因子与因子之间的相互关系。本文采用何小妮等人诱变筛得的具有稳定高产果糖基酶的米曲霉菌株[12-13],应用响应面法考察米曲霉发酵产果糖基转移酶工艺中各因素对酶活的影响,对发酵工艺进行了优化,旨在为低聚果糖的生产与开发利用提供技术参考。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

菌种米曲霉诱变融合菌株RⅢ-7,实验室筛选得到;PDA斜面、平板培养基,称取PDA培养基40.1 g,溶于1000 mL蒸馏水中配得;摇瓶发酵培养基(成分:蔗糖5%,豆粕粉2%,玉米粉0.3%)。

DRP-9082电热恒温培养箱上海森信实验仪器有限公司;SUKUN全温振荡培养器上海苏坤实业有限公司;Waters1525高效液相色谱仪美国Waters公司。

1.2实验方法

1.2.1单细胞悬浮液的制备移取10 mL无菌水至长有成熟孢子的PDA斜面,再用接种环将孢子刮至溶液,然后将含孢子的无菌水移至含玻璃珠的无菌三角瓶中,摇瓶振荡使孢子分散均匀,并移取适量无菌水使其浓度稀释至105个/mL。

1.2.2种子液的制备取孢子悬浮液200 μL接种到含有100 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中,30 ℃,150 r/min摇床培养24 h,作为接种到发酵罐中的种子液。

1.2.3发酵工艺优化的研究将200 μL米曲霉孢子悬浮液接种到含有100 mL发酵培养基的三角瓶中,按一定条件(温度、转速、pH、豆粕粉浓度、蔗糖浓度、玉米粉浓度、NaCl浓度)进行摇瓶发酵,利用高效液相色谱法测得低聚果糖的含量,并计算果糖基转移酶酶活。

在单因素实验结果的基础上选取温度、转速、pH、豆粕粉浓度、蔗糖浓度、玉米粉浓度、NaCl浓度7个因素为自变量,果糖基转移酶酶活为响应值,根据Plackett-Burman设计7因素3水平筛选实验。

由Plackett-Burman实验优化结果,设计爬坡方向,所得最优结果作为CCD响应面实验的中心点,再设计三因素五水平CCD响应面实验(α=1.682)。

表1　CCD响应面设计的因素及水平编码表Table 1　The factors and levels of code table of CCD design

1.2.4菌丝果糖基转移酶酶活检测方法称取10 g白砂糖、90 g蒸馏水于250 mL的三角瓶中,放至45 ℃、150 r/min的摇床预热、溶解,再称取0.30 g米曲霉菌丝至以上三角瓶中反应60 min;取1 mL反应液于沸水中灭活10 min,在10000 r/min的条件下离心10 min,用0.22 μm针孔滤膜过滤后,取上清液利用HPLC法检测蔗果三糖(GF2)的含量。高效液相色谱法检测酶活条件如下:

检测器:Waters2410 型示差折光检铡器;色谱柱:氨基键合柱为Inertsil NH2,填料粒度5 μm,柱长4.6 mm×250 mm;柱温:40 ℃;流动相为乙腈(色谱纯)/水=72/28;流速为1.0 mL/min;进样量:10 μL。

另外进行菌丝水分检测,称取米曲霉菌丝1.0 g左右于105 ℃的恒温培养箱中,放置4 h后取出,烘干,检测水分,综合计算菌丝干基的酶活性。

果糖基转移酶酶活定义为:在上述条件下,每1 min产生1 μmol GF2所需的酶量为1个活力单位(U)。根据酶活力的定义,按下式计算每克产酶菌丝体的酶活力X(U/g):

X=(10×1000×GF2)/[0.504×t×m×(1-y)]

式(1)

式中y，指含水量。

2　结果与讨论

2.1Plackett-Burman实验优化结果与分析

在单因素实验中,米曲霉菌株开始随着蔗糖和豆粕粉浓度的增加,菌株的酶活先升高再降低,生物量先升高后基本不变,分别在蔗糖浓度为5%、豆粕粉浓度在2%时,菌丝体的发酵酶活达到最高;在玉米粉浓度为0.3%时,米曲霉菌丝体酶活及生物量达到最大值;当在培养基中添加0.1%浓度的NaCl时,最有利于米曲霉的生长,同时有利于果糖基转移酶的产生;在对发酵条件的优化实验中,菌株在偏酸性条件下有利于产酶和菌体生长,在pH为5时,菌株产酶及生物量最高;低转速时,菌体酶活力较低,且菌丝体在发酵培养基中凝结成块,高转速条件下,菌体暗绿,开始长孢子,菌丝体酶活开始下降,转速为150 r/min时,菌丝体酶活最高;当温度在30 ℃时,可得最高酶活,温度高于或低于30 ℃时,都不利于该菌株产酶和生长。

表2　Plackett-Burman实验设计及结果Table 2　The design and results of Plackett-Burman experiment

表3　干基酶活(U/g)的方差分析Table 3　The analysis of variance dry base enzyme activity(U/g)

将影响米曲霉发酵产果糖基转移酶酶活的七个单因素:发酵温度、摇床转速、发酵pH、培养基豆粕粉浓度、蔗糖浓度、玉米粉浓度、NaCl浓度运用Plackett-Burman实验,对其进行优化,实验设计及结果如表2,并采用Minitab软件对表2进行分析,得到各因素的显著性结果,如表3。

当因素的p<0.05时,为显著性因素。由表3知,转速(p=0.002<0.05)、蔗糖浓度(p=0.013<0.05)、豆粕粉浓度(p=0.015<0.05)为显著性因素。由效应值的正负号,可知在实验范围内有正效应的因素有蔗糖浓度、转速,原因可能是蔗糖作为米曲霉生长的碳源,而另一方面蔗糖是果糖基转移酶的作用底物,增加蔗糖浓度,一定程度上可以诱导该酶的产生,而增加转速则一方面可以提高溶氧传质,另一方面可以使菌丝体分散[14],有利于米曲霉菌丝的生长及产酶;有负效应的因素是豆粕粉浓度,是因为增大豆粕粉浓度时,培养基中氮源过多,菌体生长过于旺盛,导致pH呈碱性,从而不利于米曲霉的生长以及产酶。方差分析中,R2=91.50%,说明此模型拟合较好。故从影响米曲霉发酵产果糖基转移酶酶活的7个单因素中得到3个显著性因素:转速、蔗糖浓度、豆粕粉浓度。

由Plackett-Burman实验的优化结果知,转速、蔗糖浓度对酶活的影响是正向效应,豆粕粉浓度对酶活的影响是负向效应,以此设计爬坡方向,转速、蔗糖浓度依次递增,豆粕粉浓度依次递减,实验结果如表4。

表4　最陡爬坡实验设计及其结果Table 4　The design and its results of the steepest climbing experiment

由表4得:第2组的酶活最高,故以第2组的实验参数作为响应面实验的中心点,开展响应面实验。

2.2响应面实验发酵优化结果与分析

根据爬坡实验的结果,以第2组的实验参数:转速180 r/min,蔗糖浓度5.70%,豆粕粉浓度1.90%为响应面实验中心点,每个因素设置-α、-1、0、1、+1、+α五个水平,设计CCD响应面实验,如表1。

再利用Design-Expert 8.0设计响应面实验,以X1、X2、X3为自变量,以酶活为响应值,实验结果如表5。其中实验序号1～20为析因实验,1～2、9、15～16、18为6个中心实验,用以估计实验误差。

表5　中心复合设计(CCD)响应面设计及实验结果Table 5　The design and experimental results of central composite design(CCD)response surface

对表5中的数据用Design Expert 8.0软件做回归分析,得到酶活的预测值,其中酶活的预测值Y对蔗糖浓度X1、豆粕粉浓度X2、转速X3的三元二次回归方程为:

Y=-1619.08+943.72X1-368.03X2+3.53X3+166.07X1X2-1.52X1X3+12.00X2X3-82.58X12-755.86X22-0.06X32

式(2)

由表6模型回归系数方差分析可知,方程因变量与自变量之间的线性关系明显,线性回归系数值p=0.0018<0.05,表现为显著性;失拟项系数值p=0.0614>0.05,表现为不显著性,表明实验模型拟合度较好,并且复相关系数R2=87.40%,二次方程的拟合度高,自变量与响应值之间线性关系显著,说明此模型预测结果比较准确。由F检验得,X3>X2>X1,即转速>豆粕粉浓度>蔗糖浓度,说明转速对酶活力影响最大,原因可能为转速很大程度上影响了米曲霉发酵的传质和溶氧。X3、X2X3达到了极其显著的水平,X1X2、X1X3不显著,其中蔗糖浓度与豆粕粉浓度、蔗糖浓度与转速、豆粕粉浓度与转速存在交互作用,其交互作用效果如图1所示。

表6　各因素的估计回归系数Table 6　Factors estimate of regression coefficients

图1　各因素之间的交互作用及其对酶活的影响情况Fig.1　Interaction between each factor and their influence on enzyme activity

应用响应面分析法对回归模型进行分析,得到的最优实验参数及相应的酶活为:蔗糖浓度为5.95%,豆粕粉浓度为1.60%,转速为165 r/min,酶活为895.68 U/g。采用实验所得的最佳培养基配方,进行3次平行实验,培养48 h后测定菌丝体酶活,所测酶活为870.21 U/g,与预测值895.68 U/g接近,误差为0.028%,验证该模型能较好的预测实际发酵情况。

3　结论

本文的研究内容为运用经融合诱变得到的稳定性产果糖基转移酶的米曲霉菌株,得到其优化的发酵工艺条件。首先采用Minitab软件通过Plackett-Burman实验筛选出米曲霉产果糖基转移酶发酵的显著影响因素,再用Design Expert软件联合CCD响应面实验,对发酵工艺进行进一步优化。实验结果表明,蔗糖浓度、豆粕粉浓度、转速是米曲霉产果糖基转移酶酶活的3个显著影响因素,并且转速对酶活力影响最大。此外,蔗糖浓度、豆粕粉浓度和转速之间存在着交互作用,其中豆粕粉与转速之间的交互作用显著。同时,米曲霉产果糖基转移酶最优发酵工艺条件为:蔗糖浓度5.95%、豆粕粉浓度为1.60%、转速为165 r/min,经验证实验可知在最优发酵工艺条件下,米曲霉产果糖基转移酶酶活达到870.21 U/g,与预测值895.68 U/g接近,误差为0.028%,表明该模型能较好的预测实际发酵情况,为低聚果糖中试及工业化生产提供了理论基础。

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Optimization of fermentation technology for production of fructosyltransferase withAspergillusoryzaeusing CCD response surface methods

WANG Peng,JIANG Bo,WANG Sheng-hai,FAN Sen,LIN Xiao-shan,ZHANG Yi*

(School of Bioscience and Bioengineering,South China University of Technology,Guangzhou 510006,China)

In order to produce fructosyltransferase in large scale,it is necessary to study and optimize the process conditions ofAspergillusoryzaestrains fermentation. Using sucrose,soybean meal powder and corn flour as the basic medium for fructosyltransferase synthesis in the cells,three significant factors that affect the fermentation course were selected through the Plackett-Burman optimization experiment. With analysis of the central composite design(CCD)response surface methods,the fermentation process has been further optimized and the results showed that:there were interactions between the concentration of sucrose,soybean meal powder and the rotation speed. The interaction between the concentration of soybean meal powder and the rotation speed was mainly significant. The best technical parameters were obtained as followed:the concentration of sucrose was 5.95%,the concentration of soybean meal powder was 1.60%,and the rotation speed was 165r/min. Under the optimal condition of fermentation,the enzyme activity of fructosyltransferase produced by fusion strainAspergillusoryzaeRIII-7 reached 870.21 U/g. It is close to the predictive value of 895.68 U/g,with an error of 0.028.

Aspergillusoryzae;fructosyltransferase;Plackett-Burman optimization;RSM;fermentation

2015-06-08

王鹏(1989-)，男，硕士，研究方向：发酵工程，E-mail:Mrwang_youxiang@163.com。

张毅(1964-)，男，博士，副教授，研究方向：发酵工程，E-mail:btyzhang@scut.edu.cn。

广东省科技厅产学研资助项目(2013B090600028)。

TS201.1

B

1002-0306(2016)03-0246-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.043