米黑毛霉酶凝干酪素生产工艺参数的优化研究

李学朋,关明玲,赵保堂,杨　敏,文鹏程,张忠明,张卫兵,*,师希雄,*

(1.甘肃农业大学食品科学与工程学院,甘肃兰州 730070;2.甘肃省功能乳品工程实验室,甘肃兰州 730070;3.甘肃农业大学理学院,甘肃兰州 730070)



米黑毛霉酶凝干酪素生产工艺参数的优化研究

李学朋1,2,关明玲1,2,赵保堂1,杨敏1,2,文鹏程1,2,张忠明1,张卫兵1,2,*,师希雄1,*

(1.甘肃农业大学食品科学与工程学院,甘肃兰州 730070;2.甘肃省功能乳品工程实验室,甘肃兰州 730070;3.甘肃农业大学理学院,甘肃兰州 730070)

以新鲜牛乳为原料,采用米黑毛霉凝乳酶为凝乳剂,先通过单因素实验研究凝乳酶添加量、CaCl2添加量、凝乳pH、凝乳温度对酶凝干酪素得率的影响,然后通过响应面设计进一步优化了米黑毛霉酶凝干酪素生产工艺参数。优化得到的最佳工艺参数为:凝乳酶添加量0.49%、CaCl2添加量0.37 mg/mL、凝乳pH6.08、凝乳温度35 ℃,在此条件下酶凝干酪素的得率可达3.39%。研究结果可为米黑毛霉凝乳酶在干酪素生产中的应用提供参考。

米黑毛霉,酶凝干酪素,工艺优化

酪蛋白是牛乳中一大类含磷蛋白的总称,含量约为总蛋白的80%[1]。在脱脂牛乳中加入凝乳酶,则可将酪蛋白分离沉淀出来,通过这种方法获得的酪蛋白产品为凝乳酶干酪素[2]。凝乳酶干酪素是一种蛋白含量较高的干酪素,具有良好的融化性、拉伸性、凝胶性并且有较强的染色附着力和抗挤压力,广泛应用于食品、医药、机械制造、皮革、纺织、塑料等行业[3-9]。凝乳酶干酪素生产中起关键作用的凝乳酶主要包括动物凝乳酶、植物凝乳酶和微生物凝乳酶等[10-11]。小牛皱胃酶是最为常用的动物凝乳酶,用其生产干酪素得率较高、品质较好,但来源有限、成本较高,随着经济发展通过宰杀犊牛来获得凝乳酶,已无法满足工业化发展的需求[12]。植物凝乳酶虽然在成本上有一定优势,但因蛋白水解活力高,在乳制品加工中常出现苦涩感。同时要受到时间、生长周期等诸多条件限制，因此发展有一定的局限性。微生物凝乳酶具有来源广泛、提取方便、经济效益高等的特点,是小牛皱胃酶较有潜力的替代品[13-14]。

米黑毛霉是微生物中产凝乳酶活力较高的真菌,目前关于其产酶条件、酶学性质的研究较多,但有关米黑毛霉凝乳酶在干酪素生产中应用的报道尚未见到。本实验以新鲜牛乳为原料,首先采用单因素实验研究凝乳酶添加量、CaCl2添加量、凝乳pH、凝乳温度对凝乳效果的影响,并通过响应面法优化凝乳工艺及参数,探讨工艺参数对干酪素得率的影响,为工业化生产微生物凝乳酶干酪素生产提供参考依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

新鲜牛乳甘肃农业大学奶牛场;米黑毛霉凝乳酶采用本实验室米黑毛霉发酵制备[15],凝乳酶活力为2700 SU/mL;脱脂奶粉内蒙古伊利实业集团股份有限公司。

氯化钙、盐酸等试剂均为分析纯。

AL204 电子天平梅特勒-托利多仪器上海有限公司;HWS26 型电热恒温水浴锅上海一恒科技有限公司;TDD5M 低速离心机长沙平凡仪器仪表有限公司;电热恒温鼓风干燥箱上海跃进医疗器械有限公司。

1.2实验方法

1.2.1干酪素生产工艺流程参照甘伯中[16]等人的方法并改进。

新鲜牛乳→脱脂→巴氏杀菌→添加CaCl2、凝乳酶凝乳→切割→加热收缩→排乳清→洗涤→干燥→粉碎→成品

操作要点:

(1)脱脂:将原料乳加热至38～40 ℃进行离心脱脂(4000 r/min,15 min)除去脂肪以及杂质;

(2)巴氏杀菌:63～65 ℃,30 min;

(3)凝乳:根据实验设计中不同凝乳酶添加量添加凝乳酶,适当搅拌后凝乳;

(4)切割:待完成凝乳后,用刀将凝块切为方块。

(5)加热、排乳清:缓慢升温至60 ℃并不断搅拌,控制加热时间为30 min,之后除去乳清;

(6)洗涤:加入与脱脂乳等体积的50 ℃水清洗凝乳粒,反复操作3次;

(7)干燥:鼓风干燥箱中45 ℃烘干5 h;

(8)粉碎:利用粉碎机将干燥后的干酪素粉碎。

1.2.2凝乳酶活力测定采用Arima法[17]。

1.2.3干酪素得率的测定参照刘佳[18]等人的方法。

得率(%)=酶凝干酪素质量/原料乳质量×100

1.2.4单因素实验

1.2.4.1凝乳酶添加量对干酪素得率的影响取200 mL巴氏杀菌后的脱脂乳,调整 pH为 6,加入CaCl2的量为0.3 mg/mL,添加凝乳酶的量(v/v)分别设定为0.25%、0.5%、0.75%、1%、1.25%,调节凝乳温度为40 ℃,适当搅拌后,保温 30 min,凝乳后洗涤、干燥,称重并计算得率。

1.2.4.2CaCl2添加量对干酪素得率的影响取200 mL巴氏杀菌后的脱脂乳,调整 pH为 6.0,同时分别加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的CaCl2,添加1%的凝乳酶,调节凝乳温度为 40 ℃,适当搅拌后,保温 30 min,凝乳后洗涤、干燥,称重并计算得率。

1.2.4.3凝乳pH对干酪素得率的影响取200 mL巴氏杀菌后的脱脂乳,将pH分别调整为 5.8、6.0、6.2、6.4、6.6,加入CaCl2的量为0.3 mg/mL,添加1%的凝乳酶,调节凝乳温度为 40 ℃,适当搅拌后,保温 30 min,凝乳后洗涤、干燥,称重并计算得率。

1.2.4.4凝乳温度对干酪素得率的影响取200 mL巴氏杀菌后的脱脂乳,调整pH为6.0,并加入CaCl2的量为0.3 mg/mL,添加1%的凝乳酶,调节凝乳温度分别为 25、30、35、40、45 ℃,适当搅拌后,保温 30 min,凝乳后洗涤、干燥,称重并计算得率。

1.2.5响应面设计与数据分析利用Design-Expert 7.0软件进行设计和分析。以单因素实验为基础,采用Box-Behnken实验设计进一步优化米黑毛霉凝乳酶干酪素生产工艺参数。选取影响凝乳特性的4个因素为:凝乳酶添加量(A)、CaCl2添加量(B)、凝乳pH(C)、凝乳温度(D)。每一个因素水平分别以-1、0、1编码,以得率为响应值。实验因素及水平设计见表1,实验设计及结果见表2。

表1　响应面实验设计因素水平表Table 1　Factors and levels of Box-Behnken design

1.2.6数据分析利用Design-Expert 7.0软件进行设计和分析。

2　结果与分析

2.1单因素实验结果

2.1.1凝乳酶添加量对干酪素得率的影响不同米黑毛霉凝乳酶的添加量对干酪素得率的影响如图1。由图1可以看出,酶添加量对干酪素的得率影响较大。在凝乳酶添加量为0.25%时,干酪素的得率较低为2.92%;当凝乳酶的添加量为0.5%时,干酪素的得率达到最大(3.15%);此后干酪素得率显著下降,当酶添加量为1.25%时,干酪素的得率下降至2.57%。这是因为凝乳效果对干酪素的得率有直接作用,酶浓度较低时凝乳较慢,形成的凝乳较软、易碎,水洗时损失较大,而酶浓度过高时凝乳速度加快,但是形成的凝块弹性差、易碎,水洗时损失也较大,因而使干酪素的得率降低[18]。因此,米黑毛霉凝乳酶的添加量选择0.5%。

图1　酶添加量对干酪素得率的影响Fig.1　Effect of chymosin addition amount on product yield

2.1.2CaCl2添加量对干酪素得率的影响钙离子主要影响酪蛋白酶凝过程的非酶反应阶段,它会在副酪蛋白分子间形成“钙桥”,使副酪蛋白的微粒发生团聚作用而产生凝胶体。钙离子浓度较低时,钙桥形成不完全,从而影响凝乳效果[18]。由图2可知,当添加氯化钙为0.1 mg/mL时,干酪素的得率为2.6%;随着氯化钙添加量的增加,干酪素得率迅速增加,当添加氯化钙0.3～0.4 mg/mL时,干酪素得率变化不大,此后干酪素得率缓慢下降。综上所述,选择添加氯化钙范围为0.3～0.4 mg/mL。

图2　氯化钙添加量对干酪素得率的影响Fig.2　Effect of CaCl2 addition amount on product yield

2.1.3凝乳pH对干酪素得率的影响凝乳pH会影响酶和底物的解离状态和电荷平衡,适宜的pH可以减弱它们之间的排斥作用,改善凝乳效果,从而提高干酪素的得率。过高的pH会影响酶的结构,甚至使酶变性而失活,从而影响凝乳效果并使干酪素得率下降[19]。凝乳pH对干酪素得率的影响如图3所示。当pH为5.8时,得率较低,为2.49%;此后随着凝乳pH的升高,干酪素得率呈上升趋势,当凝乳pH升至6.2时,得率最大为3.09%;当pH继续增加,干酪素得率迅速下降。因此选择 pH6.2为最适凝乳条件,在此条件下形成的凝块细腻、硬度适宜、弹性好、不易碎,乳清中损失的蛋白质少。

图3　凝乳pH对干酪素得率的影响Fig.3　Effect of curd pH on product yield

2.1.4凝乳温度对干酪素得率的影响凝乳温度对干酪素得率有一定的影响,温度较低时酶促反应较慢,凝乳不完全,另外形成的凝乳较软易碎,在后期洗涤过程中会有一定损失导致得率下降。温度过高时会导致酶失活,从而失去凝乳效果[20]。凝乳温度对干酪素得率的影响如图4所示。由图4可以看出,当凝乳温度低于35 ℃时,干酪素的得率随着温度升高逐渐增大;当温度升高至35 ℃时,干酪素得率达到最大(3.06%);此后随着温度的升高,干酪素得率逐渐减小,45 ℃时迅速降低为2.79%,说明此时酶活损失较多,影响了凝乳效果。因此,凝乳温度选择35 ℃。

图4　凝乳温度对干酪素得率的影响Fig.4　Effect of curd temperature on product yield

2.2响应面分析

根据 Box-Behnken 设计,响应面分析实验共进行了29组实验,其结果如表2所示。利用Design Expert 7.0 软件对表2实验数据进行多元回归拟合,得到回归方程如下:

R=-17.17+6.54A-0.80B+5.83C+0.16D-0.01AB+0.85AC-0.002AD+0.21BC-0.0005BD+0.0025CD-11.89A2-0.063B2-0.59C2-0.0025D2

表3　回归方程的方差分析结果Table 3　Regression equation of the results of variance analysis

由表3可以看出,模型中A、AC、BC、A2、B2、D2为显著因素,说明酶添加量、氯化钙添加量、pH、凝乳温度对干酪素得率都有一定影响,且它们之间的关系不是线性关系。通过分析回归系数可知影响干酪素得率的各因素的主次顺序为:酶添加量>pH>凝乳温度>氯化钙添加量。同时由表3可以看出酶添加量和pH、氯化钙添加量和pH之间的交互作用较显著,而其它几个因素间的交互作用不显著。

2.3最优工艺条件的确定及验证实验

采用 Design-Expert 软件预测得到干酪素得率的最大估计值为 3.44%,此时A、B、C、D四个因素对应的水平为:凝乳酶添加量为0.49%、CaCl2添加量为0.37 mg/mL、凝乳pH6.08、凝乳温度34.48 ℃。

为检验预测结果的可靠性,采用上述优化条件进行验证实验。为了在实际中操作方便,将凝乳温度修正为35 ℃,其它条件不变,进行3次验证实验,实验得出的平均得率为3.39%,与预测值差异不显著,说明优化实验的结果是可靠的。

实验得到的干酪素产品如图5所示,干燥前色泽为白色,凝块质地适中,有弹性(图5a);干燥后的凝乳颗粒表面色泽为浅黄色,内为白色(图5b);颗粒粉碎后干酪素产品为均一的白色粉末(图5c)。

图5　米黑毛霉凝乳酶干酪素产品Fig.5　Rennet casein with milk-clotting enzyme from Mucor miehei注:a.干燥前干酪素产品;b.干燥后干酪素产品; c.干燥粉碎后干酪素产品。

3　结论

通过单因素实验,Box-Behnken实验设计对米黑毛霉凝乳酶干酪素生产中凝乳工艺进行了优化,得出4个因素对干酪素得率影响大小依次为:凝乳酶添加量>凝乳pH>凝乳温度>氯化钙添加量。通过优化后得到的最佳凝乳工艺参数为:凝乳酶添加量为0.49%、CaCl2添加量为0.37 mg/mL、凝乳pH6.08、凝乳温度35 ℃。在此条件下,酶凝干酪素的理论得率为3.44%,验证实验的得率为3.39%,两者差异不显著。实验得到的干酪素产品为白色粉末。

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Research of the optimization in parameters of casein production with milk-clotting enzyme fromMucormiehei

LI Xue-peng1,2,GUAN Ming-ling1,2,ZHAO Bao-tang1,YANG Min1,2,WEN Peng-cheng1,2,ZHANG Zhong-ming1,ZHANG Wei-bing1,2,*,SHI Xi-xong1,*

(1.College of Food Science and Engineering,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China;2. Gansu Provincial Functional Dairy Engineering Laboratory,Lanzhou 730070,China;3. College of Science,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

Fresh milk was selected as the raw material andMucormieheichymosin was used as the coagulant to prepare rennet casein. First,the effects of addition volume of enzyme and CaCl2,pH and temperature on the yield of rennet casein were studied using the single factor experiment. Subsequently,the technological parameters of casein production with milk-clotting enzyme fromMucormieheiwere further optimized by Box-Behnken design. The results showed the optimum technological parameters were chymosin addition amount of 0.49%,CaCl2addition amount of 0.37 mg/mL,pH6.08 and curd temperature of 35 ℃. Under the optimal conditions,the maximum yield of rennet casein was 3.39%. The study could provide reference basis for the full utilization ofMucormieheichymosin in the production of rennet casein.

Mucormiehei;rennet casein;process optimization

2015-07-13

李学朋(1988-)，女，硕士研究生，研究方向：乳品加工，E-mail:1101266997@qq.com。

张卫兵(1974-)，男，博士，副教授，研究方向：食品微生物，E-mail:zhangwb@gsau.edu.cn。

师希雄(1977-)，男，博士，副教授，研究方向：食品加工，E-mail:shixx@gsau.edu.cn。

甘肃省农业科技创新项目(GNCX-2014-31)；国家自然科学基金项目(31560442)；“十二五”农村领域国家科技计划项目(2011AA100903)。

TS201.1

B

1002-0306(2016)03-0191-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.032