酸胁迫条件下嗜酸乳杆菌菌体细胞酶调节应答反应研究

赵瑞香,王　莹,袁　峥,梁新红,牛生洋

(河南科技学院食品学院,河南新乡 453003)



酸胁迫条件下嗜酸乳杆菌菌体细胞酶调节应答反应研究

赵瑞香,王莹,袁峥,梁新红,牛生洋

(河南科技学院食品学院,河南新乡 453003)

研究了在极端酸性环境下嗜酸乳杆菌菌体细胞通过自身相关酶活性调节对酸胁迫的应答反应。结果表明,实验菌株LactobacillusacidophilusInd-1(La-XH1)和LactobacillusacidophilusLakcid(La-XH2)在酸胁迫条件下,菌体细胞内精氨酸脱亚氨酸酶的酶活升高,pH1.5时La-XH1和La-XH2其酶活分别为4.55、4.13 μg/min·mL;胞内脲酶的活性也有所升高,在酸胁迫条件下(pH1.5)分别是1.33 U和1.26 U。通过对质子泵相关酶酶活的测定,发现在酸胁迫条件下,La-XH1菌体细胞H+-ATPase的酶活随着pH的降低而升高,pH1.5时酶活为5.49 μmol/min·L,La-XH2无明显变化,说明存在菌株的差异性;谷氨酸脱酸酶的酶活随着pH的降低其活性呈上升趋势,pH1.5时La-XH1和La-XH2的酶活分别为0.336和0.229 mmol/h·L。通过研究表明,嗜酸乳杆菌在酸胁迫条件下可以通过激活相关酶的活性来提高其耐酸性,以维持细胞在极端环境下生理活动的正常进行。

嗜酸乳杆菌,酸胁迫,酶调节,应答反应

嗜酸乳杆菌是栖息在人体肠道内的有益菌之一,当存在一定数量时,它能有效地调节肠道内有益和有害微生物菌群间的平衡,从而促进宿主的健康[1-2]。嗜酸乳杆菌多以发酵乳制品作为载体,在发酵过程中产生的乙酸和乳酸使得乳制品本身具有较低的pH,另外,在食用这些发酵乳制品的时候还要经过胃液的低酸性环境。胃液的pH因饮食结构不同波动很大,通常约为3.0,一般空腹时胃液的pH为1.5,在进食后逐渐上升到3.0～5.0[3]。因此对这些微生物来说,食品和胃中的酸性环境对它们的生存是一个很大的挑战。大量研究表明,嗜酸乳杆菌的最适pH为6.2,但其具有耐受低pH环境的能力,能够通过人体胃酸环境而进入肠道定殖下来,从而发挥其健康促进特性[4-5],但其耐酸机理至今尚无定论。

研究发现,L.lactis、L.fermentum、S.thermophilus等[6-8]许多乳酸菌中都有产碱酶的存在,产碱酶主要包括精氨酸脱亚氨酸酶和脲酶。精氨酸脱亚氨酸酶能够催化L-精氨酸最终生成瓜氨酸、氨和二氧化碳;脲酶能够催化一分子的尿素水解成一分子的二氧化碳和一分子的氨;这些产碱酶催化底物最终产生的氨会中和细胞内的H+,升高胞内的pH,从而维持胞内pH的平衡以利于生化反应的正常进行[9-10]。研究表明,像L.lactis、L.fermentum、S.thermophilus等这些乳酸菌细胞膜质子泵具有主动排出质子,调节胞内pH的能力,乳酸菌细胞膜质子泵主要包括两个酶:H+-ATPase和谷氨酸脱羧酶。H+-ATPase为胞膜结合蛋白酶,能够通过消耗胞体内的ATP,将胞内质子(H+)逆浓度梯度泵出胞外;谷氨酸脱羧酶催化L-谷氨酸与一个质子结合生成γ-氨基丁酸,消耗细胞内质子从而引起细胞内pH的增加[9,11]。因此,本研究对嗜酸乳杆菌La-XH1和La-XH2经过不同pH培养进行酸胁迫,探讨胞内产碱酶、细胞膜质子动力酶对酸胁迫的应答方应,以期找到产碱酶调节和质子泵调节与嗜酸乳杆菌耐酸能力的关系。

1　材料和方法

1.1材料与仪器

嗜酸乳杆菌LactobacillusacidophilusInd-1(简称La-XH1)和LactobacillusacidophilusLakcid(La-XH2)河南科技学院食品研究所保藏提供,培养基为MRS液体培养基[5]。

溶菌酶(20000 U/mg)上海源聚生物科技有限公司;牛血清蛋白上海源叶生物科技有限公司;钼酸铵 郑州博奥化工产品有限公司;γ-氨基丁酸 浙江益万生物技术有限公司;磷酸吡哆醛 上海谱振生物科技有限公司;L-谷氨酸钠郑州鸿祥化工有限公司;考马斯亮兰G250 上海化学试剂公司分装厂等及其他试剂均为分析纯。

PHS-3C型pH计上海精密科学仪器有限公司雷磁仪器厂;SHP-250型生化培养箱上海三发科学仪器有限公司;JY92-2D超声波细胞破碎机宁波新芝生物科技股份有限公司;HH-6型恒温水浴锅金坛市杰瑞尔电器有限公司;SW-CJ型超净工作台苏净集团安泰公司;RC5C型高速冷冻离心机美国杜邦公司;7200型可见分光度计尤尼克(上海)仪器有限公司,等。

1.2实验方法

1.2.1L-瓜氨酸标准曲线的制作取6支干净试管,按表1添加溶液,并混合均匀,避光沸水浴反应30 min,反应结束后避光冷却至室温,在490 nm下测定吸光度,以吸光度为纵坐标,L-瓜氨酸浓度为横坐标,绘制标准曲线。

1.2.2精氨酸脱亚氨酸酶的活力测定将活化的嗜酸乳杆La-XH1和La-XH2接种于pH为1.5、2.5、3.5、4.5、5.5、6.2的MRS液体培养基中,37 ℃恒温培养6 h后,6000 r/min 4 ℃离心收集湿菌体,无菌生理盐水洗涤两次,收集菌体备用(以下菌体获得方法相同)。将所收集的菌体全部转入5 mL pH为6.5的磷酸缓冲液中,低温超声破碎30 min,10000 r/min 4 ℃离心去除菌体碎片,取上清液1 mL,加入1 mL的L-精氨酸溶液,振荡10 min,二乙酰一肟测定转化液中新生成的L-瓜氨酸的量[12-13]。

表1　L-瓜氨酸标准曲线溶液配制Table 1　Preparation of L-citrulline standard curve

精氨酸脱亚氨酸酶酶活的定义:在1 min内催化L-精氨酸产生1 μg的L-瓜氨酸所需的酶量定义为一个酶活单位,即μg/min·mL。

1.2.3脲酶的活力测定按照1.3.2方法收集的菌体转入5 mL pH为7.0的磷酸缓冲液中,低温超声破碎30 min,10000 r/min离心去除菌体碎片,取上清液1 mL于试管中,加入10 mL的尿素缓冲液,迅速盖上塞子,剧烈摇动。将试管置于30 ℃的恒温水浴锅中,保持30 min。

另取1 mL上清液放入另一支试管中,加入10 mL pH7.0的磷酸缓冲液,迅速盖上塞子,将试样与缓冲液混合均匀,置于水浴锅中保持30 min,作为空白。每隔5 min将试样摇匀一次。每个试管保持30 min后,从水浴锅中取出,将上清液倒入小烧杯中。并在从水浴锅中取出恰好5 min时,测pH[14-15]。

脲酶活性计算公式:UA=pH″-pH0

式中:UA-脲酶活性,单位计作U;pH″-尿素分解后样液的pH;pH0-空白样液的pH。

1.2.4H+-ATPase活性测定

1.2.4.1H+-ATPase粗酶液的制备将经过6 h 37 ℃恒温培养的La-XH1和La-XH2以8000 r/min,4 ℃低温离心收集湿菌体,并用预冷的MgCl2溶液洗涤得湿菌体,加入pH7.2的甘氨酰-甘氨酸-KOH-MgCl2的混合缓冲液至菌体悬浊,然后加入溶菌酶50 mg,40 ℃水浴中恒温1 h。离心后,在沉淀中加入40 ℃的MgCl2溶液,40 ℃水浴30 min,离心除去未破碎的细胞,收集细胞膜。然后加入MgCl2缓冲液悬浊,并用Protein Assay试剂测定蛋白质含量,直到MgCl2缓冲液稀释的蛋白质质量浓度为100 μg/mL为止,制成粗酶液[16]。

1.2.4.2游离磷酸标准曲线制作在500 μL反应液中添加0、20、40、60、80、100 μmol/L的KH2PO4溶液200 μL,37 ℃下反应10 min,然后加入300 μL预冷的0.1 mol/L HCl终止反应。反应液在冰浴中放置10 mim后加入2 mL的发色液,18 ℃条件下发色10 min,立即在660 nm测定其吸光度,绘制标准曲线。

1.2.4.3H+-ATPase活力测定500 μL反应液中添加100 μL 的粗酶液,用上面同样的方法测定吸光度,并用沸水浴30 min灭酶活的粗酶液作为空白。参考标准曲线,以1 min内1 μmol的游离磷酸量表示1个酶活单位,即μmol/min·L[17-18]。

1.2.5谷氨酸脱酸酶的活力测定

1.2.5.1谷氨酸脱酸酶粗酶液的制备将经过6 h 37 ℃恒温培养的菌体于4 ℃下8000 r/min离心收集湿菌体,生理盐水洗涤2次离心收集菌体,加入20 mL pH4.8含1 mmol/L的巯基乙醇和0.1 mmol/L磷酸吡哆醛的混合缓冲液,冰浴中超声破碎,收集上清液,并于混合缓冲液中充分透析,离心收集上清液,作为谷氨酸脱羧酶的粗酶液。

1.2.5.2γ-氨基丁酸标准曲线制作分别取400 μL浓度分别为0、2、4、6、8、10 mmol/L的γ-氨基丁酸标准溶液,加入pH10.0 0.2 mol/L硼酸盐缓冲液500 μL、1 mol/L Na2CO3溶液100 μL、6%苯酚1 mL,混匀,加入NaClO溶液(活性氯为5.2%)1 mL,混匀后放置10 min,然后沸水浴10 min,立即冰浴20 min,待溶液出现蓝色后,加入2.0 mL 60%乙醇溶液,混匀后于20 ℃水浴中放置20 min,在630 nm测定吸光值,绘制γ-氨基丁酸标准曲线。

1.2.5.3谷氨酸脱酸酶酶活的测定取1 mL粗酶液、1 mLL-谷氨酸溶液(60 mmol/L,pH4.8)和1 mL混合缓冲液,混匀后于40 ℃反应10 h,取出置冰浴终止反应,用上述方法测定630 nm处吸光度,根据标准曲线计算γ-氨基丁酸浓度。用沸水浴30 min灭酶活的谷氨酸脱酸酶粗酶液作为空白。以1 h内1 mmol的γ-氨基丁酸作为一个酶活单位,即mmol/h·L[19-20]。

2　结果与分析

2.1L-瓜氨酸标准曲线

由图1可以看出,L-瓜氨酸在0～50 μg/mL范围内,L-瓜氨酸浓度与吸光度具有良好的线性关系,线性方程:y=0.0112x+0.0069,R2=0.998,线性关系较好,可以作为L-瓜氨酸浓度的标准曲线。

图1　L-瓜氨酸标准曲线Fig.1　The standard curve of L-citrulline

2.2酸胁迫下精氨酸脱亚氨酸酶活性调节应答反应

将不同pH下培养的La-XH1和La-XH2菌体用二乙酰一肟测定转化液中新生成的L-瓜氨酸的量,然后根据标准曲线计算出精氨酸脱亚氨酸酶的活力,结果见图2、图3。

图2　不同pH下La-XH1的精氨酸脱亚氨酸酶的活力Fig.2　The arginine deiminase activity of La-XH1 at different pH

图3　不同pH下La-XH2的精氨酸脱亚氨酸酶的活力Fig.3　The arginine deiminase activity of La-XH2 at different pH

由图2、图3可以看出,pH为1.5时,La-XH1、La-XH2的精氨酸脱亚氨酸酶的酶活较高,分别为4.55 μg/min·mL和4.13 μg/min·mL;pH为6.2时,La-XH1、La-XH2的精氨酸脱亚氨酸酶的酶活较低,分别为0.32 μg/min·mL和0.62 μg/min·mL;与pH6.2相比,pH1.5时,La-XH1的精氨酸脱亚氨酸酶的酶活上升了13倍,La-XH2的精氨酸脱亚氨酸酶的酶活上升了近6倍。说明酸胁迫激活了精氨酸脱亚氨酸酶的活性,胞内精氨酸脱亚氨酸酶活性的提高,催化L-精氨酸产氨,中和细胞内的H+,从而维持胞内pH平衡和正常生化反应,以提高自身在低pH环境下的生存能力。

2.3酸胁迫下脲酶活性调节应答反应

脲酶又称酰胺水解酶或尿素酶,能够催化尿素水解,产生氨和二氧化碳,是一种高效的分解尿素催化剂,自然界中,细菌、真菌和植物都能合成脲酶,脲酶有助于微生物利用内源性和外源性尿素作为氮源,并将其分解产生氨,而氨可以中和H+,升高胞内的pH,维持细胞在低pH条件下的相对稳定[10,21]。实验在将不同pH下培养La-XH1和La-XH2,通过pH增值法测得脲酶的活力如图4、图5。

图4　不同pH下La-XH1的脲酶的活力Fig.4　The cellular urease activity of La-XH1 at different pH

图5　不同pH下La-XH2的脲酶的活力Fig.5　The cellular urease activity of La-XH2 at different pH

由图4、图5可以看出,嗜酸乳杆菌La-XH1和La-XH2在不同pH条件下培养时,胞内的脲酶活性变化不大,pH1.5时酶活与最适pH6.2相比有一定的升高,分别是1.33 U和1.26 U,在最适pH6.2条件下培养时,胞内的脲酶活性较低,分别为0.82 U和0.79 U,说明脲酶在嗜酸乳杆菌的酸适应过程中作用不太明显。脲酶能够催化尿素水解,产生氨和二氧化碳,而氨可以中和H+,升高胞内的pH,维持细胞在低pH条件下的相对稳定[22]。

2.4游离磷酸标准曲线

由图6可以看出,在0～100 μmol/L范围时,游离磷酸浓度与吸光度呈线性关系:y=0.0072x-0.011,R2=0.9938,线性关系良好,可作为游离磷酸标准曲线。

图6　游离磷酸标准曲线Fig.6　Standard curve of free phosphoric acid

2.5酸胁迫下H+-ATPase酶活性调节

质子泵在乳酸菌维持胞内外pH的相对稳定时发挥了重要作用,其原理是依赖于ATP水解释放的能量逆浓度梯度转运氢离子。H+-ATPase和谷氨酸脱羧酶是质子泵机制的两个主要酶。H+-ATPase每逆向转移一分子的质子,就要消耗一分子ATP产生一分子游离磷酸,通过测定生成游离磷酸的量可知H+-ATPase的活性[23]。因此,实验首先在不同pH下培养La-XH1和La-XH2,测定其H+-ATPase逆向转运质子消耗ATP生成的游离磷酸的量,然后根据标准曲线计算出H+-ATPase的酶活,如图7、图8。

图7　不同pH下La-XH1的H+-ATPase的酶活Fig.7　The H+-ATPase activity of La-XH1 at different pH

图8　不同pH下La-XH2的H+-ATPase的酶活Fig.8　The H+-ATPase activity of La-XH2 at different pH

由图7、图8可以看出,La-XH1的H+-ATPase酶活最适pH6.2时为2.81 μmol/min·L,pH1.5时为5.49 μmol/min·L,酶活增加了近1倍,说明耐酸菌株La-XH1酸胁迫下H+-ATPase活性调节在酸适应过程中发挥了作用,原因是H+-ATPase可以通过消耗胞内ATP水解释放的能量,将胞内质子(H+)逆浓度梯度泵出胞外,以维持胞内pH的近中性。La-XH2的H+-ATPase的酶活在pH1.5与pH6.2时则无明显变化,说明La-XH1和La-XH2存在菌株差异性[24-25]。

2.6γ-氨基丁酸标准曲线

由图9可知,在γ-氨基丁酸浓度为0～10 mmol/L范围时,吸光度与浓度呈线性关系:y=0.0794x+0.022,R2=0.9983,线性关系较好,可作为γ-氨基丁酸浓度的标准曲线。

图9　γ-氨基丁酸标准曲线Fig.9　Standard curve of γ-Amino butyric acid

2.7酸胁迫下谷氨酸脱酸酶酶活性调节应答

谷氨酸脱羧酶可以催化L-谷氨酸与一个质子结合生成γ-氨基丁酸,消耗细胞内的质子从而使细胞内得pH的升高,它广泛存在于动物、植物和微生物中。实验在不同pH下培养La-XH1和La-XH2,测定其在酸胁迫条件下γ-氨基丁酸的生成量,然后根据标准曲线计算谷氨酸脱酸酶的酶活,结果如图10、图11。

图10　不同pH下La-XH1的谷氨酸脱酸酶的酶活Fig.10　The glutamate decarboxylase activity of La-XH1 at different pH

图11　不同pH下La-XH2的谷氨酸脱酸酶的酶活Fig.11　The glutamate decarboxylase activity of La-XH2 at different pH

由图10、图11可以看出,嗜酸乳杆菌La-XH1和La-XH2的谷氨酸脱酸酶的酶活在最适pH6.2时,其活性较小,酶活单位分别为0.053 mmol/h·L和0.016 mmol/h·L,随着pH降低,酶活增大,pH1.5时La-XH1和La-XH2活性分别达到0.336 mmol/h·L和0.229 mmol/h·L,较最适pH6.2下酶活分别升高了约5倍和13倍。另外,相同pH下,La-XH1的酶活较La-XH2的大,说明存在菌株的差异性。嗜酸乳杆菌通过激活谷氨酸脱酸酶的活性来提高其耐酸能力,主要是经过谷氨酸脱羧酶消耗胞内质子,L-谷氨酸消耗一分子H+分解为γ-氨基丁酸和CO2,升高胞内的pH,从而维持细胞内的酸碱平衡[26-27]。

3　结论

嗜酸乳杆菌是人体肠道内重要益生菌,具有较强耐酸性。当环境中的pH低于细胞生长的最适pH时,嗜酸乳杆菌维持胞内pH相对稳定的能力是其在极端环境下能够存活的重要生理功能之一。通过本实验研究表明,嗜酸乳杆菌的这种能力与菌体细胞自身酶活性的调节密不可分,通过酶调节维持菌体细胞一种宽范围的△pH,使胞内pH高于环境的pH,以维持细胞正常生理活动的进行。产碱酶的存在能催化精氨酸和尿素分解产生中和细胞内的H+的氨,从而维持胞内pH的相对稳定。在酸胁迫条件下(pH1.5),嗜酸乳杆菌细胞内的精氨酸脱亚氨酸酶的酶活升高,与最适pH6.2相比,La-XH1和La-XH2精氨酸脱亚氨酸酶的酶活分别上升了13倍和近6倍,胞内的脲酶活性变化没有精氨酸脱亚氨酸酶的活性变化大,但与最适pH6.2相比,也有所升高;通过对质子泵相关酶酶活的测定,发现在酸胁迫下La-XH1的H+-ATPase的酶活随着pH的降低而升高,耐酸菌株与最适pH下的菌株H+-ATPase的酶活相差近1倍,La-XH2无明显变化,说明存在菌株的差异性;谷氨酸脱酸酶的酶活随着pH的降低其活性呈上升趋势,pH1.5时的酶活比最适pH6.2时的酶活La-XH1和La-XH2分别升高了约5倍和13倍。总之,在酸胁迫时,嗜酸乳杆菌可以通过激活精氨酸脱亚氨酸酶、脲酶、H+-ATPase酶、谷氨酸脱酸酶等酶的活性来提高其耐酸性,以维持细胞在极端环境下生理活动的正常进行。

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Response reaction of enzyme regulation byLactobacillusacidophiluscell on acid-stress

ZHAO Rui-xiang,WANG Ying,YUAN Zheng,LIANG Xin-hong,NIU Sheng-yang

(College of Food Science,Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China)

The response reaction ofLactobacillusacidophiluscell on acid-stress through the related enzyme regulation in extremely acidic environment were studied. The result showed that the enzymatic activity of intracellular arginine deiminase of test strains,LactobacillusacidophilusInd-1(La-XH1)andLactobacillusacidophilusLakcid(La-XH2),was increased to 4.55 μg/min·mL and 4.13 μg/min·mL respectively at pH1.5.The intracellular urease activity of La-XH1 and La-XH2 was 1.33 U and 1.26 U,which were increased slightly. By analyzing the enzyme activity related to proton pump,the result showed that the H+-ATPase activity of La-XH1 was increased with the decrease of pH,and enzyme activity was 5.49 μmol/min·L at pH1.5. However,the H+-ATPase activity of La-XH2 had no significant change,which indicated La-XH1 and La-XH2 had strain differences. Meanwhile,the enzyme activity of glutamate decarboxylase had an increasing tendency with the decrease of pH,and the enzyme activity of La-XH1and La-XH2 was 0.336 mmol/h·L and 0.229 mmol/h·L respectively at pH1.5. The study indicated thatLactobacillusacidophiluscould activate the enzyme activity related to improve its acid-resistant ability on acid-stress condition,in order to maintain the normal physiological function of cells in extreme environment.

Lactobacillusacidophilus;acid-stress;enzyme regulation;response reaction

2015-07-09

赵瑞香(1966-)，女，博士，教授，研究方向：食品生物技术，E-mail：zrx338@163.com。

河南省教育厅科学技术研究重点项目(12A550004)；河南省科技攻关计划项目(122102110117)；新乡市科技创新平台建设项目(CP1310)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)03-0181-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.030