植物乳杆菌发酵对大豆分离蛋白功能性质影响研究

崔　宪,刘容旭,姜　帆,宋萧萧,柳佳彤,张莉丽,韩建春,2,*

(1.东北农业大学食品学院,黑龙江哈尔滨 150030;2.国家大豆工程技术研究中心,黑龙江哈尔滨 150000)



植物乳杆菌发酵对大豆分离蛋白功能性质影响研究

崔宪1,刘容旭1,姜帆1,宋萧萧1,柳佳彤1,张莉丽1,韩建春1,2,*

(1.东北农业大学食品学院,黑龙江哈尔滨 150030;2.国家大豆工程技术研究中心,黑龙江哈尔滨 150000)

以脱脂豆粕为原料,通过植物乳杆菌液态发酵后制备大豆分离蛋白,测定所得大豆分离蛋白的溶解性、乳化性、乳化稳定性、凝胶强度、持水性和持油性等功能性质。豆粕经发酵后所提大豆分离蛋白的溶解性、乳化性、凝胶强度、持水性和持油性均显著提高(p<0.05),乳化稳定性显著降低(p<0.05),持水性及持油性变化不大。SDS-PAGE电泳显示,豆粕经发酵后所提大豆分离蛋白在29.0～44.3 ku出现新条带,是由于乳酸菌所产蛋白酶的降解作用,大豆分离蛋白中大分子量蛋白被降解成小分子量蛋白,其中发酵对7S组分影响较大,对11S组分影响较小。经实验表明乳酸菌发酵可以有效改善大豆分离蛋白的功能性质。

植物乳杆菌,大豆分离蛋白,功能性质,发酵

脱脂豆粕是大豆油加工的副产物,大豆分离蛋白是以脱脂豆粕为原料通过碱溶酸沉制备的蛋白质含量高达90%以上的产品[1],具有较高的营养价值和较好的功能特性而成为食品配料生产中的重要原料[2]。因采用碱溶酸沉的提取方法[3],容易造成部分蛋白质变性从而使某些功能特性降低或丧失,如溶解性和乳化性等,这在一定程度上限制了它的应用范围。

对大豆分离蛋白进行功能改性是目前国内外研究的热点之一,主要的改性方法有物理改性、化学改性、酶法改性等[4]。物理改性虽然具有安全性好、作用时间短及对营养性质影响较小等优点,但改性效果并不十分明显;化学改性出于安全性的考虑,多采用基础理论的分析手段;酶法改性作用效果显著且安全可靠,但动物酶和植物酶因其提取生产复杂,价格昂贵,不适合工业化生产。而通过乳酸菌发酵技术,不仅能提高食品营养价值,改善风味,同时提高食品保藏性和附加值,目前研究表明通过控制乳酸菌在豆乳中的产酸能力,可以有效地改善大豆蛋白的凝胶特性[5],杨小佳等[6]经研究发现豆粕在固态发酵过程中,微生物与其所产蛋白酶参与了大豆蛋白的降解活动,游离氨基酸含量增多,而且改变了大豆蛋白的结构,从而改善了大豆蛋白的功能性质。刘佳等[7]使用嗜酸乳杆菌发酵大豆分离蛋白后,溶解性、吸油率均得到提高。张鹏飞等[8]研究发现经微生物发酵的豆乳,大豆抗营养因子含量降低,消化性有所提高,并通过改变氨基酸组成改善了大豆蛋白的营养品质。

为了寻求更安全、方便的改善大豆分离蛋白功能性质的方法,使用植物乳杆菌液态发酵,研究植物乳杆菌发酵对大豆分离蛋白功能性质的改变情况,为改善大豆分离蛋白功能性质的研发和生产提供一定的理论基础。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

植物乳杆菌(Lactobacillusplantrum)东北农业大学食品学院实验室保存菌种;脱脂豆粕哈高科大豆食品有限公司;MRS培养基天津市津东天正精细化学试剂厂;盐酸、氢氧化钠、牛血清蛋白、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、十二烷基硫酸钠(SDS)、Tris(三羟甲基氨基甲烷)均为分析纯。

PB-10型精密酸度计 上海仪电科学仪器股份有限公司;UV-8000A紫外分光光度计上海市元析仪器有限公司;HZQ-X100振荡培养箱哈尔滨市东联电子技术开发有限公司;TA-XT plus型质构仪北京恒峰瑞创科技发展有限公司;ALPHAL-2 LD plus冷冻干燥德国Martin Christ公司;BIO-RAD电泳仪美国BIO-RAD公司;KJELTEC 8400型全自动凯氏定氮仪丹麦FOSS公司。

1.2实验方法

1.2.1工艺流程脱脂豆粕→粉碎→过筛(80目标准筛)→磨浆去渣(按1∶12的料液比与水混合)→杀菌(95 ℃,10 min)→冷却→接入发酵剂→每隔2 h取样→碱溶酸沉[3]→透析除盐→冷冻冻干→大豆蛋白粉

1.2.2乳酸菌发酵脱脂豆乳样品制备(1)菌种活化:将乳酸菌按3%(体积比)接种于MRS液体培养基中,37 ℃培养,活化1～3次,使培养时间在12～18 h内活菌数达到1×108cfu/mL以上。(2)菌种扩大培养:取MRS液体培养基中的菌种接种于脱脂豆乳培养基中,37 ℃静止培养18 h得到乳酸菌发酵种子液。(3)发酵样品的制备:经粉碎过筛后的脱脂豆粉按1∶12的料液比加入蒸馏水,打浆过滤后95 ℃灭菌10 min,接种5%(体积比)的上述乳酸菌发酵种子液,37 ℃培养,每隔2 h取样。

1.2.3测定方法

1.2.3.1基本指标蛋白质含量的测定:依据GB/T 5009.5-2010。水分含量的测定:依据GB/T 5009.3-2010。灰分的测定:依据GB/T 5009.4-2010。粗脂肪的测定:依据GB/T 14772-2008。粗纤维的测定:依据GB/T 5009.10-2003。

1.2.3.2测定pH测定PB-10酸度计直接测定。

1.2.3.3活菌计数将发酵样品用灭菌生理盐水梯度稀释至一定倍数后采用MRS琼脂培养基平板倾注法,37 ℃培养72 h计菌落总数,测定活菌数。

1.2.3.4溶解性测定参考文献[9]，将冻干后的蛋白粉20 mg溶解于10 mL去离子水中,室温下搅拌1 h,10000×g离心20 min。采用Lowry法测定上清液中蛋白质含量,以牛血清白蛋白为标准物绘制标准曲线。蛋白质的溶解度表示为上清液蛋白含量占总蛋白含量的百分比。

1.2.3.6持水性和持油性的测定方法准确称取蛋白样品0.2 g置于离心管中,记录离心管和蛋白的总质量为m1,缓慢加入4 g的去离子水或4 g大豆油,漩涡震荡,静止放置30 min后,1600×g离心20 min,去除上清液,记录离心管、蛋白及水(或油)的总重量为m2(m3)。

持水性或持油性按下式计算:

1.2.3.7凝胶强度的测定配制12%(v/w)的蛋白溶液,90 ℃水浴加热30 min后,冷却至室温,在4 ℃冰箱内放置12 h,制得凝胶用于测定凝胶强度。用质构仪测定凝胶强度。测定模式为T.P.A,参数设置:测试前探头速度:5.0 mm/s,探头测试速度:2.0 mm/s,测试后探头速度:5.0 mm/s,选用的探头为p 0.5,下压距离为凝胶高度的50%,引发力为5 g。

1.2.3.8SDS-PAGE凝胶电泳的测定参考Laemmli[11]的SDS不连续电泳方法并做了一定程度修改。分离胶浓度12%(w/v),浓缩胶5%(w/v)。样品浓度为2 mg/mL,样品加样量为10 μL。电泳进行时恒压,浓缩胶内电压80 V,样品进入分离胶后将电压改为120 V:固定,染色,脱色,电泳成像仪拍照分析。

1.2.3.9统计分析方法所有实验重复3次,结果表示为均值±标准偏差。采用SPSS 15.0 软件对实验数据进行统计学分析。3组数据间的比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)的Duncan’s 法进行两两比较分析,显著性水平同样设定为0.05。

表1　脱脂豆粕基本指标Table 1　The basic indicators of defatted soybean flakes

2　结果与讨论

2.1脱脂豆粕基本指标

脱脂豆粕基本指标如表1所示，其中粗蛋白质含量达55.52%。

2.2发酵过程中pH变化和生长性能

将植物乳杆菌菌株活化,扩大培养后,以5%的接种量接种于脱脂豆乳中,于37 ℃的条件下培养,每隔2 h进行pH和活菌数的测定,结果见图1。研究表明,大豆制品特别是豆乳是乳酸菌生长的完全培养基[12],其中一些成分,例如低聚糖、氨基酸等均可促进乳酸菌的生长[13]。由图1表明,植物乳杆菌随着发酵时间的延长,pH不断降低,在发酵8 h时pH达到4.6,随后pH降低缓慢。植物乳杆菌在脱脂豆乳中达到了较高的活菌数,活菌数在8 h达到最高值,随着发酵时间的延长,活菌数有所下降,其活菌数最高达到8.85×108cfu/mL。

图1　脱脂豆粕乳酸菌发酵过程中pH和活菌数的变化Fig.1　Changes of pH and the viable counts basis of lactic acid bacteria in defatted soybean flakes during fermentation注：标注不同字母表示有显著性差异 (p<0.05)，图2～图5同。

2.3发酵对大豆分离蛋白溶解性的影响

蛋白含量标准曲线的线性方程为y=0.0391x-0.0403,回归系数R2=0.9992,线性良好,因此可通过该标准曲线计算出SPI溶液中蛋白质的浓度。

以脱脂豆粕为原料,经植物乳杆菌发酵,每隔2 h取样提取大豆分离蛋白,对所提蛋白测定其溶解性。结果如图2。研究表明,在豆粕发酵过程中,由于乳酸菌所产蛋白酶的酶解作用,部分大豆蛋白被降解,形成了分子量较小的肽类物质,所以其蛋白溶解性比原始豆粕中大豆蛋白的高[6]。由图2表明,豆粕经发酵后,大豆蛋白的溶解性均高于原始豆粕中大豆蛋白,在发酵达到8 h时,蛋白溶解性显著高于其他组(p<0.05),即使在发酵10 h时,发酵液pH达到大豆蛋白的等电点(pH4.5左右),其溶解性也远高于原始豆粕中大豆蛋白。随发酵时间延长,大豆蛋白溶解性有下降的趋势,这是由于当乳酸菌生长到一定时间后,菌群大量繁殖,所消耗的营养物质的速度增大,到发酵后期,豆粕中的营养物质不足以使乳酸菌产蛋白酶,蛋白酶活力也相对减少所导致的,这与吴晖[14]等人研究结果一致。

图2　发酵过程中大豆分离蛋白的溶解性Fig.2　The solubility of soybean protein during fermentation

2.4发酵对分离蛋白乳化性EAI和乳化稳定性ESI的影响

以脱脂豆粕为原料,通过植物乳杆菌发酵,每隔2 h取样提取蛋白,对所提蛋白分别测量了乳化性EAI和乳化稳定性ESI,结果如图3所示。从图3中可以看出,经发酵后提取的蛋白乳化性显著高于原始豆粕中的蛋白(p<0.05)。当发酵6 h左右时,所提蛋白的乳化性达到最高,但在发酵6～10 h之间，蛋白的乳化性差异不显著(p>0.05)。乳化性在一定程度上随发酵时间增长而有所增加,之后乳化性趋于稳定。可能是因为通过微生物的代谢作用,对氨基酸和小肽进行移接、重排和分泌[15],多肽数量增加,蛋白中疏水性氨基酸侧链外露,蛋白质分子静电荷数量上升[16]。

而原始豆粕中蛋白乳化稳定性显著高于发酵后提取的蛋白(p<0.05),豆粕经发酵后提取的蛋白乳化稳定性不好。未发酵豆乳未经过微生物发酵改性,所以分子中疏水区域结构更稳定,而经过改性后大豆蛋白的分子中疏水区域结构遭到破坏,乳化稳定性不高[17]。

图3　发酵过程中大豆分离蛋白的乳化性和乳化稳定性Fig.3　The EAI and ESI of soybean protein during fermentation

2.5发酵对分离蛋白凝胶强度的影响

以脱脂豆粕为原料,通过植物乳杆菌发酵,每隔2 h取样提取蛋白,对所提蛋白测量了凝胶强度,结果如图4所示。从图中可以看出发酵2 h时所提的蛋白凝胶强度显著高于其他组(p<0.05),经乳酸菌发酵后提取的蛋白能快速到达凝胶点[5],并随发酵时间增长凝胶强度有所降低。可能是由于乳酸菌发酵,产生大量有机酸,破坏蛋白质结构,导致三维网状结构不稳定[18]。

图4　发酵过程中大豆分离蛋白的凝胶强度Fig.4　The gel strength of soybean protein during fermentation

2.6发酵对分离蛋白持水性及持油性的影响

以脱脂豆粕为原料,通过植物乳杆菌发酵,每隔2 h取样提取蛋白,对所提蛋白测量了持水性及持油性。与未发酵提取的蛋白相比,发酵2 h时提取的蛋白持水性显著提高，持水性是蛋白与水相互作用的一个重要体现,发酵可能降低了蛋白粒度,有利于对水分子的捆绑,随发酵时间的延长，持水性有所下降,可能是发酵导致蛋白质分子结构变化,持水能力下降导致。与未经发酵所提取的蛋白相比，发酵8 h时提取的蛋白持油性显著提高(p<0.05)。但经发酵后的蛋白持水性和持油性提高幅度不大。

图5　发酵过程中大豆分离蛋白的持水性和持油性Fig.5　The water retention and oil retention of soybean protein during fermentation

2.7发酵对分离蛋白样品的SDS-PAGE分析

原始豆粕提取的大豆分离蛋白和经发酵后提取的蛋白以及标准蛋白的SDS-PAGE电泳图谱见图6。根据电泳图谱反映发酵处理对大豆分离蛋白亚基组成的影响。左数第二条泳道(0 h)是原始豆粕提取的大豆分离蛋白,可见蛋白结构比较完整,其中α′、α和β是7S亚基,A和B分别是11S的酸性亚基和碱性亚基[19]。

经乳酸菌液态发酵后,大豆分离蛋白分子量分布有明显的变化,原始豆粕中的蛋白质分子量主要分布在44.3～97.2 ku的范围内,经乳酸菌发酵后,大分子量蛋白质被降解后,分子量主要分布在29～44.3 ku的范围内,并且在44.3～66.4 ku的范围内,蛋白质分子几乎被完全降解,在29 ku和44.3 ku之间出现新条带。说明乳酸菌所产蛋白酶具有一定的降解能力。在乳酸菌发酵过程中,大豆蛋白中7S亚基在6 h和8 h条带较浅,其中β-亚基几乎消失,而11S条带几乎无变化,这说明豆粕中7S球蛋白比11S蛋白更易于降解[6],这与石慧[20]等人研究结果基本一致。

图6　发酵过程中大豆分离蛋白的 SDS-PAGE电泳图谱Fig.6　SDS-PAGE electrophoresis patterns of soybean protein during fermentation注:M为标准蛋白,0 h为未经发酵处理样品, 2、4、6、8、10 h为发酵处理样品。

3　结论

以脱脂豆粕为原料,通过植物乳杆菌液态发酵,经研究表明脱脂豆粕乳适宜乳酸菌生长,发酵周期短,活菌数最高达到8.85×108cfu/mL。发酵0、2、4、6、8、10 h后提取大豆分离蛋白进行功能性质比较,结果表明,蛋白溶解度随发酵时间增长而增大,在发酵8 h时,溶解度显著性高于其他组(p<0.05)，豆粕经发酵处理的蛋白乳化性均显著性高于未发酵处理的蛋白乳化性(p<0.05)，而未发酵处理的蛋白乳化稳定性显著高于发酵后提取的蛋白乳化稳定性(p<0.05)。蛋白质凝胶强度在发酵2 h显著性高于其他组(p<0.05)，之后随发酵时间的延长有所降低。经发酵后蛋白的持水性在发酵2 h时达到最高，持油性在发酵8 h时达到最高，经发酵后的蛋白持水性和持油性与未发酵蛋白相比提高幅度不大。经电泳分析发酵作用对分离蛋白7S组分影响较大,对11S组分影响较小,在29.0～44.3 ku出现新条带,说明发酵作用使蛋白中大分子量蛋白降解成小分子量蛋白。

[1]王浩冉.脱脂豆粕的预处理及其对大豆蛋白提取和性质的影响[D].无锡:江南大学,2012.

[2]Hu H,Wu J,Li-Chan E C Y,et al. Effects of Ultrasound on Structural and Physical Properties of Soy Protein Isolate(SPI)Dispersions[J]. Food Hydrocolloids,2013,30(2):647-655.

[3]李淑芬,胡敏.碱溶酸沉法提取大豆蛋白条件优化[J].大豆科学,2014(2):274-276,280.

[4]陈伟斌.大豆分离蛋白改性研究进展[J].粮食与油脂,2006(4):7-9.

[5]AGrygorczyk,M Corredig,et al. Acid induced gelation of soymilk,comparison between gels prepared with lactic acid bacteria and glucono-δ-lactone Original Research Article[J].

Food Chemistry,2013,141(3):1716-1721.

[6]杨小佳. 固态发酵豆粕生产大豆肽及其功能特性研究[D].郑州:河南工业大学,2014.

[7]刘佳.嗜酸乳杆菌发酵大豆分离蛋白的特性及其对面包品质的影响[D].武汉:华中农业大学,2009.

[8]张鹏飞.不同微生物液态发酵对大豆蛋白营养价值影响的研究[D].长春:吉林农业大学,2013.

[9]Lowry O H,Rosembroug H J,Lewis A,et al. Protein measure-ment with the folin phenol reagent[J]. Journal of Biological Chemistry,1951,193(1):265-275.

[10]Molina E,Ledward DA. Emulsifying properties of high pressure treated soy protein

isolate and 7S and 11S globulins[J]. Food hydrocoll,2001,15(3):263-269.

[11]Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriop Hage T4[J]. Nature,1970,227:680-685.

[10]Shimakawa Y,Matsubara S,Yuki N,et al. Evaluation of Bifidobacterium breve strain

Yakult-fermented soymilk as a Probiotic food[J].Int J Food Mierobiol,2003,81:131-136.

[11]Matsuyama J,Hirata H,Yamagishi T,et al. Fermentation Profiles and utilization of sugars of

Bifidobacteria in soymilk[J].J JPn Soc Food Sci Technol,1992,39:887-892.

[14]吴晖,卓林霞,解检清,等. 发酵条件对枯草芽孢杆菌发酵豆粕中的蛋白酶活力的影响[J]. 现代食品科技,2008,10:973-976.

[15]梁金钟,范洪臣,程丽,等.微生物液态发酵法生产大豆蛋白活性肽的研究[J].食品与发酵工业,2008(1):88-92.

[16]管军军,裘爱泳,周瑞宝.提高大豆分离蛋白乳化性及乳化稳定性的研究[J].中国油脂,2003,11:38-42.

[17]何晓哲.发酵法提高豆渣可溶性膳食纤维和蛋白质含量的研究[D].合肥:安徽农业大学,2013.

[18]刘海燕. 乳酸菌发酵豆粕及其功效研究[D].长春:吉林农业大学,2012.

[19]Tang C H,Wang X Y,Yang X Q,et al. Formation of soluble aggregates from insoluble commercial soy protein isolate by means of ultrasonic treatment and their gelling properties[J]. Journal of Food Engineering,2009,92(4):432-437.

[20]石慧,罗璇,刘艳,等.两步发酵法降解大豆抗原蛋白的研究[J].饲料工业,2011(3):22-25.

Effect of fermentation by lactobacillus plantrum on functional properties of soybean protein

CUI Xian1,LIU Rong-xu1,JIANG Fan1,SONG Xiao-xiao1,LIU Jia-tong1,ZHANG Li-li1,HAN Jian-chun1,2,*

(1.College of Food Science,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2.The National Research Center of Soybean Engineering and Technology,Harbin 150000,China)

The defatted soybean meal was used as raw materials,and suffered liquid fermentation byLactobacillus. Then soybean protein was extracted from fermented solubility. The emulsification,emulsion stability,gel strength,water holding capacity,oil holding capacity and some other functional properties of soybean protein were determined. The results indicated that the solubility,EAI,gel strength,water holding capacity and oil holding capacity were significantly improved after fermentation(p<0.05),ESI was significantly lower(p<0.05) while the water holding capacity and the oil holding capacity had little changes during this process. SDS-PAGE electrophoresis demonstrated that soy protein after fermentation emergence of new bangs between 29.0～44.3 ku,high molecular weight proteins of soybean were degraded into small molecular weight proteins,among which fermentation had a greater impact on the 7S component and less impact on the 11S component. The test showed that lactobacillus can effectively improve the functional properties of soy protein.

lactobacillusplantrum;soybean protein;functional properties;fermentation

2015-05-19

崔宪(1989-)，男，硕士研究生，研究方向：农产品加工及贮藏，E-mail：cuixianneau@163.com。

韩建春(1973-)，男，博士，教授，研究方向：农产品加工，E-mail：hanjianchun@hotmail.com。

国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2013AA102208)，东北农业大学“青年才俊”项目(14QC42)。

TS229

A

1002-0306(2016)03-0177-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.029