辽西传统发酵食品中抗单增李斯特菌乳酸菌的筛选与鉴定

吕欣然,李　莹,马欢欢,缪璐欢,杜静芳,白凤翎,李　春,励建荣

(渤海大学食品科学与工程学院,辽宁省食品安全重点实验室,生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心,辽宁锦州 121013)



辽西传统发酵食品中抗单增李斯特菌乳酸菌的筛选与鉴定

吕欣然,李莹,马欢欢,缪璐欢,杜静芳,白凤翎*,李春,励建荣

(渤海大学食品科学与工程学院,辽宁省食品安全重点实验室,生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心,辽宁锦州 121013)

目的:从传统辽西发酵食品中筛选对单增李斯特菌具有良好拮抗作用的乳酸菌菌株。方法:采用双层琼脂扩散法筛选乳酸菌优良菌株。采用酸性实验、热处理实验、蛋白酶敏感性实验分析拮抗特性,利用生长曲线分析拮抗物质形成过程,扫描电镜分析细胞结构完整性。通过生理生化实验和16S rRNA序列进行菌株鉴定。结果:从13株乳酸菌中筛选出1株抗单增李斯特菌活性较强的菌株DL3,抗菌物质存在于无细胞上清液中。经胃蛋白酶处理后抑菌活性丧失了27.50%,胰蛋白酶和木瓜蛋白酶可使抑菌活性完全丧失,经121 ℃处理15 min后,抑菌活性仍保留 96.88%,在pH2.5～6.5时具有抑菌活性,表明菌株DL3产生的抑菌物质可能为细菌素。添加菌株DL3无细胞上清液可使单增李斯特菌的生长曲线延迟期和稳定期延长4 h,显著地缩短了其生长期。扫描电镜结果表明经菌株DL3无细胞上清液处理的单增李斯特菌菌体变小且边缘模糊不清,其中一端细胞原生质发生泄漏。经鉴定菌株DL3为植物乳杆菌。结论:获得1株对单增李斯特菌有较强拮抗活性的植物乳杆菌DL3,该菌的拮抗活性物质可能为细菌素,可作为食品防腐剂潜在的应用菌株。

传统发酵食品,乳酸菌,拮抗,单增李斯特菌,筛选与鉴定

乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)通过生态位竞争、形成酸性环境、产生拮抗性代谢产物和细菌素等方式控制食品中的腐败和致病微生物[1],传统发酵食品如发酵乳制品、泡菜、发酵香肠、酵头和发酵鱼制品[2-6]等都是拮抗性乳酸菌的重要来源。

乳酸菌素是乳酸菌在生长代谢过程中通过自身核糖体合成的一类具有抑菌活性的蛋白类物质,具有高效、安全、无毒等特点[7]。通常分为四类:Ⅰ类羊毛硫细菌素,分子量小于5 ku,带有特殊的氨基酸,nisin就属于这一类[8];Ⅱ类细菌素分子量小于10 ku,对热稳定且无修饰的肽段[9];Ⅲ类细菌素分子量大于30 ku,为不耐热的蛋白质[8];Ⅳ类细菌素可与其他基团形成复杂的大分子化合物[10]。乳酸菌素是与食品发酵密切相关的次级代谢产物,现已成为天然防腐剂研究的热点。

单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)是一种广泛存在于乳制品、水产品和肉制品等食品中的嗜冷菌,能在1～45 ℃和低pH条件下生长,还具有耐盐能力。因此,由单增李斯特菌导致的食物中毒非常普遍[11]。控制食品中单增李斯特菌的污染是食品安全较为突出的问题之一。目前筛选抗单增李斯特菌的乳酸菌菌株所产生的乳酸菌素包括乳杆菌素sakacin、乳酸片球菌素和明串珠菌素[12]。Chahad等[13]从鲈鱼和海鲤中分离84株乳酸菌,鉴定为肠球菌属,其无细胞上清液经蛋白酶和热处理后对单增李斯特菌仍具有抑菌活性,抑菌活性物质为Ⅱ型细菌素。Kingcha等[14]研究发现产细菌素的PediococcuspentosaceusBCC 3772对单增李斯特菌有较强的抑菌活性,可接种到传统发酵香肠Nahm作为发酵剂及改善产品的品质。目前,由于Nisin杀菌机制与应用比较清楚,已被很多国家批准应用于食品工业[15]。而对于其他类型的乳酸菌素的研究还很有限,分离和筛选产乳酸菌素的优良菌株,并对其抑菌作用和机理进行深入研究,为研发高效的生物防腐剂具有重要的理论和应用价值。

本文从辽西地区腌制的酸菜、泡菜、芥菜、黄豆酱和酸黄瓜中分离7株乳酸菌和保藏的6株标准乳酸菌为供试菌,以标准单增李斯特菌为指示菌,采用双层平板琼脂扩散法筛选产细菌素的乳酸菌,并对其抑菌活性和抑菌物质的特性及生理特性进行初步研究,为开发乳酸菌生物防腐剂奠定基础。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

实验供试菌株见表1,其中7株从辽西地区传统发酵酸菜、朝鲜泡菜、芥菜、黄豆酱和酸黄瓜中分离,6株标准乳酸菌由渤海大学食品科学研究院保藏提供。指示菌株单增李斯特菌(L.monocytogenesATCC19115),上海北诺生物科技有限公司。

表1　分离菌株和标准菌株一览表Table 1　List of strains with isolate and standard

MRS培养基,胰酪蛋白胨培养基(TSB)北京奥博星生物技术有限公司;胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶华蓝化学有限公司;其他化学试剂北京奥博星生物技术有限公司。乳酸菌生化鉴定管杭州天和微生物试剂有限公司;细菌基因组DNA快速抽提试剂盒、DNA marker-D、Taq PCR Master mix上海生工生物工程有限公司。

SPX-250生化培养箱宁波海曙赛福实验仪器厂;5804R高速冷冻离心机德国Eppendorf公司;GI54DS高压灭菌锅至微仪器有限公司;DL-CJ-2N超级洁净工作台北京市东联哈尔仪器制造有限公司;VICTORTMX3酶标仪美国珀金埃尔墨股份有限公司,E-1045镀金仪日本日立公司;S-4800扫描电镜日本日立公司;PCR仪,德国Eppendorf公司;Quantity one凝胶成像系统美国Bio-Rad公司;IKA Vortex GENIUS 3振荡器德国IKA公司。

1.2实验方法

1.2.1无细胞上清液(cell free supernatants,CFS)、菌体和菌悬液的制备

1.2.1.1乳酸菌CFS和菌体将-80 ℃保存的菌株接种于MRS液体培养基,37 ℃传代培养2次后,以2%的接种量接种于500 mL MRS培养基,静置37 ℃培养12 h。4 ℃下 6000 r/min离心15 min,上清液用0.45 μm滤菌器过滤除菌,得CFS 425 mL,菌体用无菌生理盐水洗涤3次,重悬于生理盐水中使菌浓度约106CFU/mL,4 ℃冰箱保存备用。

1.2.1.2单增李斯特菌菌悬液将-80 ℃保存的菌株接种于TSB培养基37 ℃培养12 h,以1.0%的接种量传代培养1次后,用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释,制成约106CFU/mL菌悬液,冰箱4 ℃保存备用。

1.2.2菌株抑菌作用测定以乳酸菌为供试菌,单增李斯特菌为指示菌,乳酸菌CFS和菌体的抑菌作用参照文献[16]采用双层琼脂扩散法进行测定。

1.2.3乳酸菌CFS抑菌作用的影响因素实验

1.2.3.1pH的影响将乳酸菌CFS用1.0 mol/L的NaOH和1.0 mol/L乳酸分别调pH为2.5、3.5、4.0、4.5、5.5、6.5,同时将MRS液体培养基调制相同的pH为对照,按1.2.2的方法进行测定。

1.2.3.2热处理的影响将乳酸菌CFS在50 ℃和100 ℃下作用30 min,在121 ℃下作用15 min,同时以乳酸菌CFS作为对照,按1.2.2的方法进行测定。

1.2.3.3酶处理的影响将乳酸菌CFS分别用1.0 mol/L NaOH或1.0 mol/L HCl调至酶的最佳pH(胃蛋白酶pH2.0,木瓜蛋白酶pH7.0,胰蛋白酶pH7.5),分别添加至乳酸菌CFS使其终浓度为1.0 mg/mL。在37 ℃下孵育4 h,调pH至代谢产物初始pH,同时以乳酸菌CFS为对照,按1.2.2的方法进行测定。

1.2.4乳酸菌CFS对单增李斯特菌生长的影响

1.2.4.1最小抑菌浓度MIC的测定采用液体二倍稀释法,用TSB液体培养基将浓缩100倍的乳酸菌CFS稀释至终浓度分别为32.0、16.0、8.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0.25、0.125 mg/mL。分别取5.0 mL为实验组,以不加CFS的TSB培养基为对照组,分别加入200 μL指示菌菌悬液,30 ℃ 150 r/min培养24 h,以肉眼观察,没有变浑浊的最低浓度为CFS的最小抑菌浓度,每组重复3次。

1.2.4.2乳酸菌CFS对单增李斯特菌生长的影响在106CFU/mL指示菌菌悬液中加入乳酸菌CFS,使其终浓度为0.4 MIC,置于30 ℃下150 r/min振荡培养24 h。每隔2 h用酶标仪在590 nm测OD值,同时用不加CFS的菌悬液作对照,以时间为横坐标,以OD值为纵坐标制作乳酸菌生长抗菌活性曲线。

1.2.5扫描电镜分析乳酸菌CFS对单增李斯特菌细胞结构的影响按照文献[17]的方法稍微调整。以加入0.4倍MIC浓度的CFS为实验组,以不加CFS为对照组。两组各取5 mL分别加入200 μL浓度为106CFU/mL单核增生李斯特菌菌悬液,30 ℃下,150 r/min培养12 h。6000 r/min离心10 min收集菌体,菌体用无菌水洗涤3次。菌体在2.5%戊二醛0.1 mol/L(pH7.2)磷酸缓冲液中4 ℃ 固定12 h,用0.1 mol/L(pH7.2)磷酸缓冲液洗涤3次洗去残留的戊二醛,洗涤后的菌体用无菌水悬浮,悬浮时菌体密度不要过大。取适量滴于洁净盖玻片上,真空干燥12 h,喷金,用扫描电镜进行观察。

1.2.6乳酸菌菌株鉴定

1.2.6.1生理生化实验参照东秀珠的《常见细菌系统鉴定手册》和凌代文的《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》进行生理生化鉴定[18-19]。

1.2.6.2分子生物学鉴定乳酸菌DNA采用细菌基因组试剂盒提取。PCR扩增引物为:27f:5′-AGAG TTTGATCCTGGCTCAG-3′,1492r:5′-TACGGYTACC TTTGTTACGACTT-3′。PCR扩增反应体系(25 μL):上下游引物各1.0 μL,DNA模板1.0 μL,Taq PCR Master mix 12.5 μL,ddH2O 9.5 μL。PCR扩增反应程序:94 ℃ 2 min,94 ℃ 1 min,60 ℃ 1 min,72 ℃ 90 s,循环30次,4 ℃保温。PCR纯化产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析后送上海生工生物工程股份有限公司测序。测得序列登陆GenBank进行BLAST同源性比较,应用MEGA 5.0软件构建系统发育进化树。

1.2.7数据处理所有实验均重复测定 3 次,数据采用平均值±标准差表示。采用SPSS 18.0软件对实验数据进行统计和显著性分析,采用Origin 8.0软件进行制图。

2　结果与讨论

2.1乳酸菌对单增李斯特菌的抑制作用

13株乳酸菌对单增李斯特菌抑菌作用结果见表2,从中可以看出,菌株DL1、DL3、DL10、C10、CH-2、D400、LP-B和LH-9均具有抑菌活性,而DL6、DL11、DL12、DL15和RH11均无抑菌效果,菌株DL10的抑菌直径最大达到14.66 mm。13株乳酸菌菌体对单增李斯特菌均没有抑菌活性。结果表明菌株的抑菌活性物质存在于乳酸菌的无细胞代谢产物中。

表2　乳酸菌对单增李斯特菌的抑制作用结果Table 2　Antagonistic effect of LAB against L. monocytogenes

注:“-” 表示无抑菌活性。

2.2乳酸菌CFS抑菌作用的影响因素实验结果

2.2.1 pH的影响图1是8株对单增李斯特菌有抑菌活性的乳酸菌株在不同pH条件下的抑菌活性变化情况,从图中可看出,乳酸菌CFS的抑菌活性随着pH的升高呈现逐渐降低趋势,其中,当pH2.5时,总体抑菌效果最好;当pH4.0时,总体抑菌活性明显降低,此时,对照组则完全失去抑菌活性,表明菌株CFS中除含有乳酸等酸性代谢物质,还具有其他抑菌活性产物。当pH4.5～6.5时,只有菌株DL3还具有抑菌活性,表明该菌株的抑菌活性成分在弱碱性条件下仍具有抑菌作用。据Tramer等[20]研究发现Nisin在pH2.0时抑菌稳定性很好,在pH5.0时失去40%活性,在pH6.0时失去90%的活性。菌株DL3可能产生类似Nisin抑菌物质,因此,选择DL3为后续研究菌株。

图1　pH对菌株DL3拮抗单增李斯特菌活性的影响Fig.1　Effect of pH on the antagonistic activity of strain DL3 against L. monocytogenes

2.2.2热处理的影响不同温度热处理后,菌株DL3 CFS的抑菌活性变化结果如表3所示,从中可以看出,菌株DL3的代谢产物经50 ℃ 30 min、100 ℃ 30 min和121 ℃处理15 min后,对单增李斯特菌的抑菌活性仍保留原活性的98.96%、98.64%和96.88%,表明其代谢产物对热具有较强的稳定性。

表3　热处理对菌株DL3抗单增李斯特菌活性的影响Table 3　Effect of thermal treatment on the antagonistic activity of strain DL3 against L. monocytogenes

2.2.3酶处理的影响表4是菌株DL3 CFS经胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶处理后抗单增李斯特菌的抑菌结果,从中可以看出,菌株代谢产物经胃蛋白酶处理后对单增李斯特菌的抑菌活性丢失了27.50%,经胰蛋白酶和木瓜蛋白酶处理后的抑菌活性完全丧失,表明菌株DL3的抑菌活性物质对胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶均敏感,而对胃蛋白酶仍保留一定活性,可能是胃蛋白酶的最适pH偏低的缘故。实验结果可进一步证实菌株DL3的抑菌活性物质可能是细菌素类物质。

表4　酶处理对菌株DL3抗单增李斯特菌活性的影响Table 4　Effect of proteases treatment on the antagonistic activity of strain DL3 against L. monocytogenes

注:“-”代表无抑菌活性。

2.3乳酸菌CFS对单增李斯特菌生长的影响

通过肉眼观察,菌株DL3对单增李斯特菌的最小抑菌浓度MIC为4 mg/mL。在单增李斯特菌菌悬液添加菌株DL3 CFS后的时间生长曲线如图2所示,从图中可以看出,添加乳酸菌CFS实验组的单增李斯特菌的生长曲线相对滞后,其中进入延迟期和稳定期的时间比对照组延长4 h,明显缩短了单增李斯特菌的对数期的生长速率和生长期,平均的细菌OD值与对照组呈现显著性下降,表明乳酸菌CFS对单增李斯特菌生长具有较强的抑制作用。Saraoui等[21]研究表明,单增李斯特菌与菌株LactococcuspisciumCNCMI-4031混合培养24 h后,数量减少了3～4 log CFU/g,表明菌株Lc.pisciumCNCMI-4031能抑制单增李斯特菌的生长速率。本研究结果与其结果相类似。

图2　菌株DL3 CFS对单增李斯特菌生长的影响Fig.2　Effect of DL3 CFS on the growth curve of L. monocytogenes

2.4乳酸菌CFS对单增李斯特菌细胞结构作用的扫描电镜结果

图3是单增李斯特菌细胞与菌株DL3 CFS共同作用后扫描电镜观察菌体细胞的结果,从图中可以看出,未处理单增李斯特菌细胞形态完整,呈杆状,两端圆钝,且表面圆润较光滑。经CFS处理的菌体细胞结构不完整,菌体变小且边缘模糊不清,其中一端发生细胞原生质泄漏。说明乳酸菌CFS对单增李斯特菌细胞结构具有较强的损伤破坏作用。

图3　乳酸菌DL3 CFS对单增李斯特菌细胞结构的影响Fig.3　Effect of DL3 CFS on the cells structure of L. monocytogenes注:a:对照组,b:实验组。

2.5乳酸菌菌株鉴定结果

表5为菌株DL3的生理生化鉴定结果。通过结果可以看出菌株DL3可发酵蔗糖、甘露醇、甘露糖、山梨醇、纤维二糖、麦芽糖、水杨苷、葡萄糖、蜜二糖、阿拉伯糖、乳糖、半乳糖、果糖、七叶苷等多种糖类,不是以氧化葡萄糖作为唯一的碳源,明胶不液化。查阅文献[18-19]可初步断定菌株为植物乳杆菌(Lb.plantarum)。

表5　菌株DL3的生理生化鉴定结果Table 5　Physiological and biochemical results of strain DL3

注:“+”表示生理生化反应呈阳性,“-” 表示生理生化反应呈阴性。

图4是菌株DL3的16S rRNA基因扩增电泳图,从图中可以看到在1500 bp处出现特异性亮带,表明目标片段被成功扩增。将菌株测序结果与NCBI数据库中已知序列进行比对,构建系统发育树,结果见图5,由图5可以看出,菌株DL3与Lb.plantarum(GU 138604)在同一个分支上,同源性为98%,结合菌株的初步鉴定结果,菌株DL3鉴定为植物乳杆菌(Lb.plantarum)。

图4　菌株DL3的16S rRNA基因扩增电泳图Fig.4　PCR amplification of 16S rRNA gene of strain DL3

图5　菌株DL3的16S rRNA系统发育树Fig.5　The phylogenetic tree for sequences of strain DL3

3　结论

从传统辽西发酵酸菜中筛选到1株具有良好抗单增李斯特菌的乳酸菌菌株DL3,其抗菌作用来自于CFS中。在低酸性条件下,菌株DL3表现较强抗菌活性,且在pH4.5～6.5时仍具有抑菌活性。菌株CFS经胃蛋白酶处理后对单增李斯特菌抑菌活性丢失了27.50%,胰蛋白酶和木瓜蛋白酶可使抑菌活性完全丢失,在121 ℃处理15 min后抑菌活性仍保留96.88%,表明菌株DL3产生的抑菌活性物质可能为细菌素。添加乳酸菌CFS可使单增李斯特菌的生长曲线延迟期和稳定期延长4 h,显著地缩短了单增李斯特菌的生长期,表明乳酸菌CFS较强地抑制单增李斯特菌的生长。扫描电镜结果表明经乳酸菌CFS处理的单增李斯特菌菌体细胞结构不完整,菌体变小且边缘模糊不清,其中一端发生细胞原生质泄漏。经鉴定菌株DL3为植物乳杆菌(Lb.plantarum)。

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Screening and identification of lactic acid bacteria with anti-Listeriamonocytogenesfrom traditional fermented food in western Liaoning province

LV Xin-ran,LI Ying,MA Huan-huan,MIAO Lu-huan,DU Jing-fang,BAI Feng-ling*,LI Chun,LI Jian-rong

(College of Food Science and Technology,Bohai University;Food Safety Key Lab of Liaoning Province;National & Local Joint Engineering Research Center of Storage,Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products,Jinzhou 121013,China)

Objective:To isolate lactic acid bacteria(LAB)from traditional fermented foods in western Liaoning province,with outstanding inhibitory activity againstListeriamonocytogenes. Methods:LAB with anti-L.monocytogeneswere screened by double agar diffusion methods. The antibacterial substance was analyzed using acid test,heat-treated test and protease sensitivity test,the forming process of antibacterial substance was analyzed by growth curve,the integrity of cellular structure was observed by scanning electron microscope. The strains were identified by biochemical characteristics and 16S rRNA sequence analysis. Results:Strain DL3 with outstanding inhibitory activity againstL.monocytogeneswas screened from 13 strains LAB,and the antibacterial substance mainly existed in cell-free supernatants(CFS). The inhibitory activity of CFS lost 27.50% by treating with pepsin,and inhibitory activity entirely lost by treating with trypsin and papain. The antibacterial activity of CFS still remained 96.88% by thermal treatment under 121 ℃ for 15 min,and was effective within pH2.5～pH6.5. The inhibitory substance of strain DL3 produced was preliminary determined as bacteriocin. The growth curve ofL.monocytogeneslag phase and stationary phase were extended four hours by mixing CFS of LAB,which significantly shorted the logarithmic growth ofL.monocytogenes. Observation under scanning electron microscope revealed that cell ofL.monocytogenesbecame smaller and edge blur,and an apparent hole at one of the cell poles with intracellular component leakage. Strain DL3 was identified asLactobacillusplantarum. Conclusion:Lb.plantarumDL3 with outstanding inhibitory activity againstL.monocytogeneswas screened,and its antibacterial substance was preliminary determined as bacteriocin. The strain DL3 had great application prospects on the development of natural bio-preservative.

traditional fermented foods;lactic acid bacteria;antagonism;Listeriamonocytogenes;screening and identification

2015-04-29

吕欣然(1990-)，女，硕士研究生，研究方向：食品质量与安全控制，E-mail:lvxinran1990@163.com。

白凤翎(1964-)，男，博士，教授，研究方向：食品质量与安全控制和食品微生物学,E-mail:baifling1990@163.com。

“十二五”国家科技支撑计划课题(2012BAD29B06)；辽宁省高等学校创新团队课题(LT2014024)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)03-0143-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.022