樟树籽仁蛋白的组成及功能性质研究

李露敏,代红发,王报贵,陈绪军,肖彦骏,曾哲灵

(1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,江西南昌 330047;2.南昌大学食品学院,江西南昌 330047;3.南昌大学环境与化学工程学院,江西南昌 330031)



樟树籽仁蛋白的组成及功能性质研究

李露敏1,2,代红发1,2,王报贵1,2,陈绪军1,2,肖彦骏1,2,曾哲灵1,3,*

(1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,江西南昌 330047;2.南昌大学食品学院,江西南昌 330047;3.南昌大学环境与化学工程学院,江西南昌 330031)

采用以石油醚低温脱脂的樟树籽仁为原料,按照Osborne蛋白分级提取方法对樟树籽仁蛋白进行精细的分类,分别得到了樟树籽仁清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白四种组分,分别占总蛋白的25.64%、23.51%、2.32%和30.14%。在此基础上,研究了各蛋白组分的功能性质,包括溶解性、吸水性、吸油性、乳化性和乳化稳定性以及起泡性和起泡稳定性。结果表明,樟树籽仁清蛋白的溶解性、吸水性、乳化性及乳化稳定性和起泡性及其稳定性较好,分别为59.15%、2.5 g/g、72.92%、80%和123%。樟树籽仁球蛋白的吸油性最好,为4.19 g/g。

樟树籽仁,蛋白,Osborne分级,功能性质

樟树(Cinnamomum camphora)属樟科常绿大乔木,树冠大、枝叶繁茂、生长快,全株散发的特有清香具有清除蚊虫的作用[1]。在中国南部各省都有广泛种植,欧洲、美国、越南、日本等地亦有分布。每年的秋末冬初,作为中国南方普遍种植的绿化树种,樟树会产生大量的樟树籽。樟树籽,异名樟梨、香樟子、大木姜子、樟木子等[2]。果实成熟季节大量的樟树籽落于地面,对城市环境造成比较大的影响,同时加大环卫工作的劳动强度。

樟树籽仁含有40%左右的油脂,除此之外还含有大量的蛋白质,可作为一种新型的植物蛋白质资源。植物蛋白具有很高的营养价值和良好的功能性质,如作为食品添加物添加到食品中,不仅可以提高食品营养价值,还可以改善食品的结构和品质。目前,对于樟树籽的研究主要集中在樟树籽仁油、樟树籽壳色素的提取方法和应用、主要成分的分析和结构研究,而作为其副产物,樟树籽仁蛋白质的研究国内外少有报道,对于植物蛋白质资源的开发和利用是一种极大的损失。因此本研究以樟树籽仁为原料进行深加工,采用Osborne分级法对樟树籽仁蛋白进行分离,并对几种蛋白组分的功能性质进行研究,不仅可以提高樟树籽的利用率,为植物蛋白提供新的来源,而且能为樟树籽仁蛋白的规模应用与产品开发提供科学的理论和数据支持。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

樟树籽采摘于江西某大学校园;氯化钠、氢氧化钠、石油醚、无水乙醇、考马斯亮蓝G-250、牛血清蛋白国药集团化学试剂有限公司。

BS223电子天平德国赛多利斯有限公司;WFZ765PC紫外可见分光光度计上海光谱仪器有限公司;LGJ-1冷冻干燥机、PHS-2F型PH计上海精密科学仪器有限公司雷磁仪器厂;TGL-16G高速台式离心机上海安亭科学仪器厂;FOSS全自动凯氏定氮仪江苏科学仪器有限公司;85-2恒温磁力搅拌器江苏中大仪器厂。

1.2实验方法

1.2.1原料的预处理樟树籽脱壳后得樟树籽仁,樟树籽仁经高速粉碎机粉碎后在60 ℃的条件下用石油醚脱脂4 h,重复两次,风干后过80 目筛,4 ℃下保存。

1.2.2基本成分分析水分的测定:105 ℃恒重法(GB/T5009-2003);灰分的测定:灼烧法(GB/T5009-2003);粗蛋白的测定:微量凯氏定氮法(GB/T5009-2003);粗脂肪的测定:索氏提取法(GB/T5009-2003)。

1.2.3樟树籽仁分离蛋白组分的制备称取一定量的樟树籽仁粉末,加入10倍体积蒸馏水,40 ℃恒温水浴锅中搅拌浸提2 h,4000 r/min离心20 min得上清液和沉淀A,将沉淀A重复提取一次,合并两次所得上清液,将上清液加入预处理好的活性炭进行脱色,4500 r/min离心20 min得上清液,加入α-淀粉酶(pH6.5,温度45 ℃)处理一定时间后调节pH至清蛋白等电点,静置一段时间,5000 r/min离心20 min,将沉淀于去离子水中4 ℃透析72 h后冷冻干燥得清蛋白冻干样品;向沉淀A中加入10倍体积浓度为2%的NaCl溶液,40 ℃恒温下搅拌浸提2 h后4000 r/min离心20 min得上清液和沉淀B。重复一次,合并两次所得上清液,在上清液中加入预处理的活性炭进行脱色处理,4500 r/min离心20 min后,加入α-淀粉酶(pH6.5,温度45 ℃)处理一定时间后调节pH至球蛋白等电点,静置一段时间,5000 r/min离心20 min,将沉淀于去离子水中4 ℃透析72 h后冷冻干燥得球蛋白样品;向沉淀B中加入10倍体积的70%的乙醇溶液,40 ℃恒温水浴2 h后4000 r/min离心得上清液和沉淀C。重复一次,合并两次所得上清液,在上清液中加入预处理的活性炭进行脱色处理,4500 r/min离心20 min,将上清液于40 ℃下旋转蒸发,加入三倍体积的去离子水进行稀释,稀释液于去离子水中4 ℃透析72 h后冷冻干燥得醇溶蛋白样品;向沉淀C中加入10倍体积的0.005 mol/L的NaOH浓液,40 ℃水浴2 h后4000 r/min离心得上清液和沉淀D。重复一次,合并两次所得上清液,将上清液加入预处理好的活性炭进行脱色处理,4500 r/min离心20 min得上清液,加入α-淀粉酶(pH6.5,温度45 ℃)处理一定时间后调节pH至谷蛋白等电点,静置一段时间,5000 r/min离心20 min,将沉淀于去离子水中4 ℃透析72 h后冷冻干燥得谷蛋白样品。

1.2.4成分分析蛋白质含量测定:可溶性部分采用Bradford法测定[3];沉淀物采用凯氏定氮法[4]。

1.2.5樟树籽仁分离蛋白功能性质的测定

1.2.5.1溶解性的测定称取一定量的四种样品蛋白于10 mL离心管中,加入5 mL水。用玻璃棒搅拌,并用0.5 mol/L HCl或NaOH溶液在2 min内调节到不同的pH(2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0),磁力搅拌20 min后离心(4000 r/min)20 min,吸取上清液,测定其中的蛋白质的含量[5-6]。

NSI(%)=(水溶液中的蛋白含量/样品中的蛋白含量)×100

1.2.5.2吸水性和吸油性的测定吸水性：称取一定量的四种样品蛋白于离心管中,逐步加入少量一定pH(1、3、5、7、9)的蒸馏水,玻璃棒搅拌至样品呈现浆状、无水析出,再加入1～5 mL蒸馏水冲洗后,使混合物于一定温度(25、35、45、55、65 ℃)静置30 min后,于4000 r/min离心5 min,倾去离心管中多余的水,称取沉淀的质量[7],根据公式计算计算樟树籽仁蛋白的持水性:持水力(g水/g样品)=(离心后残留物物重-样品干重)/样品干重

吸油性：称取一定量的四种样品蛋白于离心管中,加入5 mL樟树籽仁油,用玻璃棒搅拌均匀,在一定温度(25、35、45、55、65 ℃)静置30 min后,以4000 r/min离心10 min,倾去离心管中多余的油,称取沉淀的质量[8],根据以下公式计算樟树籽仁蛋白的吸油性:吸油性(g油/g样品)=(离心后残留物物重-样品干重)/样品干重

1.2.5.3乳化性(EAI)及乳化稳定性(ESI)的测定乳化性：称取一定量的四种蛋白样品溶于25 mL蒸馏水中,用0.5 mol/L的HCl或NaOH调至不同pH,加入相同体积的樟树籽仁油,在一定温度恒温水浴放置30 min,然后在胶体磨中均质2 min,快速移取10 mL上述乳化物放入带有刻度的离心管中,以2500 r/min的速度离心10 min[9],根据公式计算樟树籽仁蛋白的乳化性:EAI(%)=乳化层高度/离心管液体总高度×100。

乳化稳定性：将上述测定完乳化性后的样品,于60 ℃恒温水浴中放置30 min,用自来水冷却至室温,以2500 r/min的速度离心10 min,测定此时乳化层高度[10],根据公式计算樟树籽仁蛋白乳化稳定性:ESI(%)=离心管中仍保持乳化层高度/初始乳化层高度×100

1.2.5.4起泡性(FC)及起泡稳定性(FSC)的测定起泡性 称取一定量的四种樟树籽仁蛋白样品溶于100 mL蒸馏水中,配制成一定浓度的蛋白质溶液(w/v),并用0.5 mol/L的HCl或NaOH调至不同pH,在35 ℃恒温水浴中放置20 min,在磁力搅拌器上高速搅拌2 min,快速记录搅拌停止时泡沫的体积[11],根据公式计算樟树籽仁蛋白的起泡性:FC(%)=搅拌停止时泡沫的体积/100×100

起泡稳定性 在室温条件下,记录搅拌停止30 min后泡沫体积,根据公式计算樟树籽仁蛋白的起泡性稳定性:FSC(%)=泡沫体积/初始泡沫体积×100

2　结果与分析

2.1樟树籽仁基本成分的测定结果

表1　樟树籽仁的基本成分Table 1　The basic components of Camphor Seed Kernel

注:各项目分别平行测定三次,数据标准偏差±5%被认为可接受,下同。

表2　樟树籽仁各类蛋白相对百分含量Table 2　Distribution of Osborne fractions of Camphor Seed Kernel protein

由表1可以知,樟树籽仁中脂肪所占的比例最大,达58.02%,其次为蛋白质,含量为18.15%。因此,樟树籽仁蛋白可作为是一种新型的植物蛋白质资源,具有很大的开发潜力。

2.2樟树籽仁蛋白的分级提取

表2给出了樟树籽仁蛋白各组分的含量。从表2的数据来看,樟树籽仁中含量最多的蛋白质为谷蛋白,占蛋白总量的30.14%,清蛋白和球蛋白次之,分别占25.64%和23.51%,樟树籽仁醇溶蛋白含量最少,占2.32%。还有不足20%的不溶性蛋白残留在残渣中。

2.3功能性质测定

蛋白质的功能特性指蛋白产品在食品加工、贮藏和销售过程中对人们所期望的食品特征产生影响或做出贡献的某些物理、化学特性的总称。一般将其分为四个主要的方面:水化性质、表面性质、结构性质和感官性质[12]。

2.3.1溶解性蛋白质的溶解度是蛋白质-蛋白质和蛋白质-溶剂相互作用达到平衡的热力学表现形式。作为食品蛋白质原料的首要条件是蛋白质的溶解性要好,因为蛋白质的水溶性直接影响着其乳化性、胶凝性、起泡性等其他功能特性,决定着蛋白质在食品加工产品中的稳定性、风味等。蛋白质溶解度的大小与pH、离子强度、温度和蛋白质浓度等有关。

在其他条件相同的条件下,樟树籽仁分离蛋白的溶解度随pH变化关系如图2所示。从图2可以看出,在pH2～pH10的范围内,樟树籽仁四种分离蛋白的溶解性都呈先减少后增加的趋势。清蛋白在极低pH或在碱性条件下溶解度明显更好,最大溶解度达到68.13%(pH10),当pH为3时,溶解度最小为15.81%。球蛋白在pH为3是溶解度有最低值为10.85%,最大溶解度为39.81%。醇溶蛋白最大溶解度为18.39%,随pH变化趋势不是很明显。谷蛋白在pH为4时有最小溶解度为7.09%。四种蛋白中清蛋白的溶解度最好,醇溶蛋白的溶解度最差。

图2　不同pH下樟树籽仁分离蛋白溶解度的变化Fig.2　The influence of pH value on four kind camphor seed kernel protein solubility

2.3.2吸水性 蛋白质的吸水性与食品的粘度有关,它受pH、温度和离子强度等因素的影响。图3为樟树籽仁分离蛋白在不同pH的条件下吸水性的变化。

图3　不同pH下樟树籽仁分离蛋白的吸水性Fig.3　Effect of PH value on four kinds camphor seed kernel protein water holding capacity (WHC)

蛋白质的吸水作用源于蛋白质分子表面的极性基团与极性分子具有亲和力,其结果和分子中极性基团数目有关[13]。由图3可以看出,樟树籽仁各分离蛋白的吸水性随着pH的增大呈先减小后增大的趋势。清蛋白的吸水性在pH为3时达到最小值为1.7 g/g,此后随着pH的增大而增大,当pH为9时清蛋白的吸水性达到最大值4.1 g/g。球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白的吸水性的变化趋势和清蛋白的相同,当pH为3时球蛋白和醇溶蛋白的吸水性有最小值为1.3 g/g和0.7 g/g,pH为5时,谷蛋白的吸水性有最小值为0.9 g/g。这是因为pH可影响改变蛋白质分子的离子作用、带电荷数,从而改变蛋白分子间相互作用以及与水分子间结合能力。当pH处于等电点附近时,蛋白质分子表面总电荷为零,此时分子间相互作用最大,收缩、缔合的蛋白质呈现出最低的水化和膨胀性质。

除了pH对蛋白质的吸水性有影响外,温度对蛋白质的吸水性也有一定的影响,见图4。

图4　不同温度下樟树籽仁分离蛋白的吸水性Fig.4　Effect of temperature on four kinds camphor tree seed kernel protein WHC

由图4可以看出,樟树籽仁清蛋白、球蛋白、谷蛋白的吸水性随温度的逐渐增大都呈先增加后减小的趋势,醇溶蛋白的吸水性随着温度的逐渐增大而逐渐减小。可能的原因是,在低温条件下,蛋白质分子随温度的上升,蛋白发生适度变性,伸展性增大,蛋白分子与水分子间作用增大,从而提高了产品的吸水性。随着温度的继续上升,蛋白分子氢键作用和离子基团的水合作用减弱、水解程度加剧,或是蛋白变性发生聚集作用,从而使蛋白表面吸水性下降。在温度为35 ℃,清蛋白和谷蛋白的吸水性达到最大值,分别为3.4 g/g和2.0 g/g。球蛋白在温度为45 ℃时有最大吸水量2.9 g/g,醇溶蛋白在温度为25 ℃时有最大吸水量为2.1 g/g。

2.3.3吸油性吸油性是指蛋白产品吸附油的能力,它与蛋白质的来源、蛋白质的浓度、种类、加工方法、温度等因素有关,同时与所选用的油脂也有很大关系,樟树籽仁油各分离蛋白在不同温度下的吸油性如图5。

图5　不同温度下樟树籽仁分离蛋白的吸油性Fig.5　Effect of temperature on four kind camphor seed kernel protein oil holding capacity

由图5可知,在25～35 ℃时,樟树籽仁四种分离蛋白的吸油性较好,但随着温度的升高,蛋白质的吸油性逐渐减小。这是因为温度的升高使得油的粘性降低、流动性增大,减弱与蛋白分子的结合,从而使蛋白的吸油性降低,与文献数据结果一致[14]。在25～35 ℃的条件下,球蛋白的吸油性最好,最大值达4.2 g/g,谷蛋白次之,为4.0 g/g,醇溶蛋白的吸油性最小,为3.5 g/g。除温度外,蛋白质的吸油性还受其它条件的影响,即使相同的样品相同的条件而不同测试者之间的结果差异也较大。

2.3.4乳化性和乳化稳定性蛋白质乳化能力是指蛋白样品与油水结合在一起,形成乳状液经相转变(从由O/W转变成W/O)的能力;乳化稳定性是指油水乳化液保持稳定的能力。这使得蛋白质可在食品乳胶起稳定作用,可作为重要食品添加成分。影响蛋白质乳化性和乳化稳定性的因素很多,如温度、pH、离子强度、蛋白质浓度等。相同条件下不同pH各分离蛋白的乳化性和乳化稳定性如图6、图7所示。

图6　pH对樟树籽仁分离蛋白的乳化性影响Fig.6　Effect of pH on camphor seed kernel protein EAI

从图6、图7可以看出,樟树籽仁四种分离蛋白的乳化性和乳化稳定性呈先减少后增加的趋势。在pH3～pH9的范围内,四种分离蛋白的乳化性和乳化稳定性都逐渐增加,在碱性条件下乳化性和乳化稳定性均达到最大值。当pH为9时,清蛋白有最大乳化性为73%,乳化稳定性为83%,谷蛋白的乳化性最小为54%。这变化趋势可能和蛋白质的等电点有关,在等电点附近时蛋白分子所带电荷为零,静电排斥作用使得蛋白溶解度最小,在蛋白颗粒表面又无法形成水化层,从而使得形成的乳化粒子易发生絮凝和聚集,乳化能力最弱。在偏离等电点时,蛋白溶解性增加,蛋白质向油/水界面扩散能力增强,乳化颗粒间静电斥力作用使乳化能力增强,保持其形成乳化液能力增强。

2.3.5起泡性和起泡稳定性蛋白质能作为起泡剂主要取决于蛋白质的表面活性和成膜性,蛋白质的起泡性是指蛋白质在搅打过程中扑捉气体形成泡沫的能力,稳定性是指蛋白质维持泡沫稳定的能力。起泡性和起泡稳定性主要和蛋白质的浓度、pH和离子强度等因素等有关。相同条件下不同pH各分离蛋白的起泡性和起泡稳定性如图8、图9所示。

图8　不同pH下樟树籽仁分离蛋白的起泡性Fig.8　Effect of PH on camphor seed kernel protein FC

图9　不同pH下樟树籽仁分离蛋白的起泡稳定性Fig.9　Effect of pH on camphor seed kernel protein FSC

从图8、图9可以看出,樟树籽仁分离蛋白的起泡性随pH的变化呈先减小后增大的趋势,而起泡稳定性随pH的变化呈先增大后减小的趋势,即起泡性好时相对应的起泡稳定性相对较差。樟树籽仁清蛋白与其它组分相比,具有更好的起泡性和起泡稳定性,当pH为9时起泡性达到最大值118%,起泡稳定性也达到58%。球蛋白和谷蛋白的起泡性和起泡稳定性次之,醇溶蛋白的最差,可能是由于其溶解度较差的原因造成的。在等电点附近时,蛋白质的起泡性较差,而起泡稳定性较好,可能的原因是,当pH在等电点附近时,参与形成泡沫的蛋白浓度较低,使得其泡沫量最少,但此时不溶性颗粒由于静电作用吸附于气-液界面,使得蛋白膜黏性、厚度增大,泡沫稳定性增加。

3　结论

用脱脂后的樟树籽仁为原料,采用Osborne分级法从中分离得到樟树籽仁清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白4种成分,其含量分别为:25.64%、23.51%、2.32%和30.14%。樟树籽仁清蛋白具有较好的溶解性和吸水性,在pH为9和pH10时,其溶解性和吸水性分别达到最大值68.13%和4.1 g/g;与其它三种分离蛋白相比,樟树籽仁清蛋白的乳化性和乳化稳定性、起泡性和起泡稳定性也相对较高。与樟树籽仁清蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白相比,樟树籽仁球蛋白的吸油性较高,在25 ℃时,吸油性达到最大值4.2 g/g。植物蛋白作为一种重要的营养物质和功能性物质,已经有很多科研团队深入研究了不同植物来源的蛋白及其生物活性。樟树作为中国南部地区分布极为广泛的常青类树种,樟树籽来源丰富。本文通过对其中的蛋白功能性质的研究,在充分利用自然资源的同时,对于开发新型植物蛋白和新型食品种类具有非常重要的理论指导意义。有研究人员对樟树籽仁中的蛋白进行生物活性研究,其表现出一定的抗肿瘤和抗艾滋病病毒等独特功能性质[15-17]。总而言之,作为一种常见但还未被深入研究的优质植物蛋白,樟树籽仁蛋白具有很大的开发潜力。

[1]闰文德. 樟树生理生态特性及其林分生物产量的研究[D].Study on the Antibacterial Activity of Red 2 3 4湖南株洲:中南林学院,2003:4-14.

[2]田淑芹. 《中药大辞典》11种检索功能综述[J]. 中国科技信息,2006(02A):175-175.

[3]Bradford M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Analytical biochemistry,1976,72(1):248-254.

[4]王肇慈.粮油食品品质分析(第二版)[M].北京：中国轻工业出版社,2000.

[5]马勇,周佩. 榛子粉的主要成分和功能特性研究[J]. 食品

与发酵工业,2009,34(11):72-75.

[6]Deeslie W D,Cheryan M. Functional properties of soy protein hydrolyzates from a continuous ultrafiltration reactor[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,1988,36(1):26-31.

[7]葛毅强,郑如力. 脱脂麦胚蛋白功能特性的研究[J]. 中国油脂,2000,25(4):53-56.

[8]张维农,刘大川. 花生蛋白产品功能特性的研究[J]. 中国油脂,2002,27(5):60-65.

[9]曾卫国. 花生蛋白溶解性和乳化性的研究[J]. 农产品加工. 学刊,2005(1):16-18.

[10]Pearce K N,Kinsella J E. Emulsifying properties of proteins:evaluation of a turbidimetric technique[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,1978,26(3):716-723.

[11]张春红,周小婷. 小麦胚蛋白分级提取及功能性研究[J].粮油加工,2009(5):94-96.

[12]高海燕,赵镭,尹京苑,等. 棉籽分离蛋白功能性质的研究[J]. 食品科学,2009,29(11):72-76.

[13]Chou D H,Morr C V. Protein-water interactions and functional properties[J]. Journal of the American oil chemists' Society,1979,56(1):A53-A62.

[14]吴晓红,刘经纬,郑月明,等. 红松种子水溶性蛋白吸水性,吸油性及溶解性的研究[J]. 食品工业科技,2010(9):140-143.

[15]李卫林. 樟树籽中生物活性物质的研究进展[J]. 武夷学院学报,2012,31(2):37-40.

[16]Yang Q,Liu R,Gong Z,et al. Studies of three genes encoding Cinnamomin(a type II RIP)isolated from the seeds of camphor tree and their expression patterns[J]. Gene,2002,284(1):215-223.

[17]He W J,Liu W Y. Cinnamomin:a multifunctional type II ribosome-inactivating protein[J]. The international journal of biochemistry & cell biology,2003,35(7):1021-1027.

Study on the components and functional properties of camphor seed kernel protein

LI Lu-min1,2,DAI Hong-fa1,2,WANG Bao-gui1,2,CHEN Xu-jun1,2,XIAO Yan-jun1,2,ZENG Zhe-ling1,3,*

(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China;2.School of Food Science,Nanchang University,Nanchang 330047,China;3.School of Environmental and Chemical Engineering,Nanchang 330031,China.)

Defatted by petroleum ether,the raw material-camphor seed kernel-was used as the source of protein,according to Osborne protein extraction method for grading,to be fine sorted. Four components were obtained:camphor tree seed kernel albumin,globulin,gliadin and gluten,respectively accounted for 25.64%,23.51%,2.32% and 30.14% of total protein. Then on this basis,the functional properties of those protein components,including solubility,water absorption,oil absorption capacity,emulsification and emulsion stability,and foaming and foaming stability were measured. The results showed that the solubility,water absorption,emulsification and foaming emulsion stability of camphor seed kernel albumin acted better,59.15%,2.5 g/g,72.92%,80% and 123%,respectively. The best seed kernel globulin camphor oil absorption capacity was 4.19 g/g.

camphor seed kernel;protein;Osborne fractionation;functional properties

2015-06-05

李露敏(1991-),女,硕士,研究方向:食物(含生物质)资源开发与利用,E-mail:496865450@qq.com。

曾哲灵(1965-),男,博士,研究方向：生物资源开发与利用,E-mail:zlzengjx@163.com。

江西省高等学校科技落地计划项目(KJLD12012)。

TS202.1

B

1002-0306(2016)03-0069-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.005