远东拟沙丁鱼蛋白多肽(Sardinopssagaxp olypeptide)的制备及其对酪氨酸酶的抑制作用

李亚会,吉　薇,吉宏武,2,3,*,苏伟明,2,王晶晶

(1.广东海洋大学食品科技学院,广东湛江 524088;2.广东省水产品加工与安全重点实验室,广东湛江 524088;3.水产品深加工广东省普通高校重点实验室,广东湛江 524088)



远东拟沙丁鱼蛋白多肽(Sardinopssagaxpolypeptide)的制备及其对酪氨酸酶的抑制作用

李亚会1,吉薇1,吉宏武1,2,3,*,苏伟明1,2,王晶晶1

(1.广东海洋大学食品科技学院,广东湛江 524088;2.广东省水产品加工与安全重点实验室,广东湛江 524088;3.水产品深加工广东省普通高校重点实验室,广东湛江 524088)

以远东拟沙丁鱼为原料,采用动物蛋白水解酶和风味酶联合水解,通过膜分离等工序制备远东拟沙丁鱼蛋白多肽(SardinopssagaxPolypeptide/SSP),测定其分子量的分布,以生化水平上对酪氨酸酶的抑制率、细胞水平上对小鼠B16细胞中酪氨酸酶活性及黑色素含量的抑制率为检测指标,研究SSP对酪氨酸酶活性及黑色素合成的影响。结果显示:SSP的重均分子量为1664 u,其分子量区间主要为500～3000 u;无论是在生化水平还是细胞水平上,SSP对酪氨酸酶都具有一定的抑制作用,且SSP还能在一定程度上抑制细胞中黑色素的合成,这一结果表明了SSP具有一定的美白功能,有望作为无毒副作用的天然酪氨酸酶抑制剂,在医药、食品、化妆品等行业具有广泛的应用前景。

远东拟沙丁鱼,蛋白多肽,酪氨酸酶活性,黑色素含量

酪氨酸酶是含铜的需氧酶类,含有多个亚基,每个亚基含两个铜离子,每个铜离子分别与三个组氨酸残基共价结合,构成其活性中心[1]。酪氨酸酶是黑色素形成的关键酶,而人皮肤中黑色素含量直接决定了皮肤的白皙程度。因此可以通过抑制酪氨酸酶的活性来抑制黑色素的生成,从而达到美白功效[2]。

目前市面上已经逐渐从借助物理性遮盖美白向黑色素还原的生理性美白转化。常见的美白活性成分主要有曲酸及其衍生物,熊果苷,水杨酸等[3]。由于天然产物安全性好、生理活性强,因此天然产物作为美白剂成为化妆品行业的一个发展趋势,能够满足了消费者的需求[4]。海洋生物活性肽是从海洋生物中得到的,由于海洋生物相比陆地生物具有特殊的生态环境(如高盐,高压、缺氧等),赋予了他们一些特殊的化学结构[5]。王静风等[6]报道,鱿鱼皮胶原蛋白多肽具有降低黑色素含量和抑制酪氨酸酶活性的功能;王奕等[7]报道,日本刺参胶原肽具有抑制酪氨酸酶活性。远东拟沙丁鱼(Sardinopssagax),又名斑点莎脑鱼,具有分布广、生长快、繁殖力强、价格低廉等优点[8]。据报道远东拟沙丁鱼蛋白多肽具有抑制ACE酶[9]、抗免疫、抗氧化[10]等多种生物活性。因此本文选用远东拟沙丁鱼为原料,通过蛋白酶酶解和膜分离[11]等技术制备远东拟沙丁鱼蛋白多肽,研究其对酪氨酸酶活性的抑制作用,进一步通过细胞实验来验证样品对小鼠B16细胞中酪氨酸酶活性及黑色素含量的抑制作用,为其在美白化妆品中的应用提供一定的理论基础。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

远东拟沙丁鱼(Sardinopssagax),购于湛江市东风市场。

小鼠B16黑色素瘤细胞购于中山大学细胞库;高糖DMEM培养基、0.25%胰蛋白酶、青霉素、链霉素GIBCO公司;胎牛血清、L-DOPA、曲酸均购于广州市齐云生物技术有限公司;MTT、DMSO、TritonX-100Amresco公司;96孔板、24孔板、6孔板康宁;酪氨酸酶worthingtom;L-酪氨酸华蓝集团;动物蛋白水解酶(14.5万U/g)、风味酶(14万U/g)南宁庞博生物工程有限公司;DPPH试剂、曲酸广州市齐云生物技术有限公司;其他试剂均为分析纯。

MCO-175型CO2培养箱Thermo公司;SW-CJ-2FD型超净工作台苏州净化有限公司;CKX41-A32PH型倒置显微镜日本奥林巴斯公司;MμLtiskanGO全波长多功能酶标仪Thermo Fisher Scientific公司;FA2104A分析天平上海天平仪器厂;SHZ-B水浴恒温振荡器江苏金坛市佳美仪器公司;Agilent LC 1200液相色谱仪美国安捷伦公司;TM-CM-01陶瓷膜分离设备(SG1812C 8175396 100 u反渗透膜、88688246 3000 u超滤膜)杭州沃腾有限公司。

1.2实验方法

1.2.1远东拟沙丁鱼蛋白多肽的制备工艺流程:远东拟沙丁鱼→前处理→酶解→灭酶→离心→脱油→脱色(活性炭)→过分子筛(60目)→超滤→反渗透→旋转蒸发→冷冻干燥→得到样品远东拟沙丁鱼蛋白多肽(SSP)。

将远东拟沙丁鱼(100 g)去头去内脏,清洗,打浆,在适宜的酶解条件下反应3 h(动物蛋白水解酶0.5%、风味酶0.1%,温度50 ℃,自然pH),之后在90 ℃条件下灭酶10 min,4000 r/min离心,取上清液于管式离心机中脱油,再加入活性炭脱色,过60目的筛,得到的澄清液用截留分子量为3000 u的超滤膜超滤,再用反渗透膜去除小分子物质,最后得到分子量区间大致在200～3000 u的多肽样品,再将其在50 ℃条件下旋转蒸发,冷冻干燥之后得到干粉(13.4 g)。保存在干燥器中备用。

1.2.2SSP的分子量测定以SDS-PAGE超低分子量标准蛋白质(20100、14400、7823、5856、3312 u);马尿酰-组氨酸-亮氨酸(429.47 u)为相对分子质量标准品,采用高效液相空间排阻法测定,根据所测得分子量作相对分子量校正曲线,之后在相同条件下测定样品的分子量。将冷冻干燥样品溶于超纯水,配置浓度为2 mg/mL。条件如下:色谱柱为Waters protein pak 60(300 nm×7.8 nm);柱温25 ℃;流动相:pH7.2的Tris-HCl;流速:0.7 mL/min;检测波长214 nm;进样量20 μL。

1.2.3酪氨酸酶抑制率的测定根据参考文献[12]的操作方法,稍作修改。酪氨酸酶抑制率的测定方法见表1。

表1　酪氨酸酶抑制率测定方法Table 1　Determination method of Tyrosinase Inhibition

注:先将前三种溶液混匀,于37 ℃水浴锅中保温10 min,加入酪氨酸酶摇匀后,37 ℃保温30 min后立即在475 nm条件下测定其吸光度。

酪氨酸酶抑制率:

式中:A1代表不加样品,酪氨酸酶与L-酪氨酸反应产生的吸光度;A2代表不加样品,L-酪氨酸所产生的吸光度;A3代表添加样品,酪氨酸酶与L-酪氨酸反应产生的吸光度;A4代表样品与酪氨酸所产生的吸光度。

1.2.4小鼠B16黑色素瘤细胞的培养在无菌条件下,将购买的B16黑色素瘤细胞接种于含10%胎牛血清、双抗(100∶1)的高糖DMEM培养基中,置于5% CO2培养箱37 ℃饱和湿度培养,每24 h换液。当细胞生长至培养瓶的80%～90%后,经0.25%胰蛋白酶消化,传代并继续培养[13]。每次实验取自同一传代细胞。

1.2.5MTT比色法测定细胞存活率参考文献[14]的操作方法,稍作修改。取对数期生长的小鼠B16黑色素瘤细胞,经0.25%胰蛋白酶消化分散成单个细胞悬液,调整细胞浓度至2×104/孔,接种到96孔板中,隔夜培养后,至细胞完全贴壁,换新鲜培养液,每孔加入不同浓度的样品SSP(25、50、75、100、125 μg/mL)和曲酸(25、125 μg/mL)每个浓度设置5个复孔,对照组用新鲜培养液代替,每隔一天测定一次(共测3 d),采用PBS清洗两次后,每孔加20 μL的5 mg/mL MTT和180 μL EMDM培养基,继续放在CO2培养箱中培养4 h后,弃掉培养液,加入200 μL DMSO,振荡均匀后于酶标仪中测定在570 nm条件下的吸光度。

细胞存活率计算公式:

1.2.6SSP对小鼠B16 黑色素瘤细胞酪氨酸酶活性的影响参考文献[15]的操作方法,稍作修改。细胞培养与细胞处理如上述1.2.4,培养1、2、3 d后,弃除上清液,用PBS清洗2次,每孔加入含0.9 mL 1%TritionX-100和0.1 mL 5 mg/mL的L-DOPA,混匀后置于30 ℃培养箱中反应1 h后,置于酶标仪中测定475 nm条件下的吸光度。

酪氨酸酶的抑制率计算公式:

1.2.7SSP对小鼠B16 黑色素瘤细胞中黑色素含量的影响参考文献[16]的操作方法,稍作修改。细胞培养与细胞处理如上述1.2.4,调整细胞数为1×106个/孔,添加到6孔板中培养,培养1、2、3 d后,弃除上清液,用PBS清洗2次,每孔加入1 mol/L的氢氧化钠1 mL,用细胞刮器将细胞刮下来,置于1.5 mL离心管中,在80 ℃条件下加热1 h,冷却后在1500×g离心10 min,吸取上清液200 μL,置于96孔板中,于酶标仪测定475 nm条件下的吸光度。

黑色素含量的抑制率:

1.3数据处理与分析

使用SPSS和Excel2013软件进行数据处理和方差分析,采用Origin 8.0软件绘图。重复实验3次,以平均值±标准误来表示。

2　结果与分析

2.1SSP的分子量分布

根据标准品测定得到的图谱(图1)。以保留时间(x)和分子量的对数(y)作图,得到分子量回归方程为:y=-0.208x+6.045,R2=0.9905(如图2)。根据图2的标准曲线方程,结合SSP样品所测得分子量分布图谱(如图3),计算得到样品的分子量分布区间(表2)。

图1　标准样品的出峰图谱Fig.1　The spectrum of the stanurd sample

图2　标准样品保留时间对应其分子量的对数值Fig.2　The logarithm of molecular weight of stanurd sample’s retention time

图3　SSP的分子量分布图谱Fig.3　Distribution of molecular weight of SSP

由表2可知,虽然经过3000 u的超滤膜过滤后,但由于其组分复杂,所测得的分子量范围还存在大于3000 u的组分,可能与该膜的性能、透过压力[17]等有一定的关系,故不能完全保证分子量一定在3000 u以下。分子量在3000 u以下的组分约占75%,其中2000～3000 u之间的组分占32.27%;1000～2000 u之间的组分占13.17%;500～1000 u之间的组分占14.17%。表2中还显示SSP的数均分子量和重均分子量分别为2752.86、1664 u。

表2　肽的分子量分布Table 2　Distribution of peptide molecular weight

根据国内外研究报道了一些来自海洋类的生物活性肽的分子量,发现较强活性的功能肽主要集中在3000 u以下[18]。不同来源的提取物得到的分子量不同,不同分子量的肽也表现出不同的生物活性[5]。宋永相等报道[19],相对分子质量小于1000 u的海洋活性胶原肽对酪氨酸酶有较好的抑制作用;王静凤等[20]报道,不同分子量鱿鱼皮胶原蛋白多肽SP1(Mr>10000 u)、SP2(6000u

2.2SSP对酪氨酸酶活性的影响

由图4可知:在一定浓度(1～10 mg/mL)范围内,随着SSP浓度增大,其对酪氨酸酶的抑制作用逐渐增强,说明SSP在生化水平上对酪氨酸酶能表现出较强的抑制作用其结果与报道相符。陈龙等[23]报道,20 g/L质量浓度的鱼胶原肽溶液的酪氨酸酶抑制率可以达到30%以上,远强于市场上的同类产品;王静风等[6]报道,鱿鱼皮胶原蛋白多肽具有降低黑色素含量和抑制酪氨酸酶活性的功能。其可能原因是SSP能够破坏酪氨酸酶的活性中心,使其活性降低。Rao Fu等[24]报道酪氨酸酶的抑制作用可能与铜离子螯合能力有一定相关性,能通过络合铜离子而抑制酪氨酸酶活性。由图中看出当曲酸浓度只有0.1 mg/mL时,其抑制率将近40%,当浓度为1 mg/mL时,其抑制率达到90%,说明SSP与市面上酪氨酸酶抑制剂相比还是存在一定差距,但是曲酸作为酪氨酸酶抑制剂应用于美白化妆品仍然存在一定的争议[25],因此其使用受到一定限制。

图4　SSP和曲酸对酪氨酸酶活性的影响Fig.4　Effect of kojic acid and SSP on tyrosinase activity注:横坐标轴刻度的“曲酸0.1”表示曲酸浓度为 0.1 mg/mL,“曲酸1”表示曲酸浓度为1 mg/mL。

2.3SSP对小鼠B16存活率的影响

由图5中可知:在处理的1、2 d中可以看出在样品组25～100 μg/mL浓度范围内,随着浓度的增加,小鼠B16细胞数量呈现出增加的趋势(即细胞存活率>100%),当浓度达到125 μg/mL时,细胞数量有所降低,但是其存活率在80%以上。在样品处理的2 d内,SSP可能作为一种营养物质对细胞的生长具有促进的作用,所以细胞数量明显增加[26]。而当细胞培养到3 d时,细胞数量有所降低,可能是由于细胞数量增加,所需要的营养增多,而供给的营养不足而且细胞之间也存在相互的竞争,导致细胞数量略微降低,但是整体来说SSP对细胞的生长具有促进的作用,因此可以判定SSP对细胞无毒害作用。该结果与国内外学者报道相同,范成成[27]研究发现从文蛤中分离得到的一种多肽不仅抑制B16黑色素瘤细胞的增长,而且能激活细胞的增长,这表明该海洋活性物质对细胞无毒害作用,且对细胞具有营养的效果。相比较而言,曲酸对B16细胞的生长具有一定的抑制作用,说明曲酸对小鼠B16细胞存在一定的不良刺激作用。

图5　SSP和曲酸对小鼠B16黑色素瘤细胞生长的影响Fig.5　Effect of kojic acid and SSP on B16 murine melanoma cells growth注:横坐标轴刻度的“曲酸25”表示曲酸浓度为25 μg/mL, “曲酸125”表示曲酸浓度为125 μg/mL。图6、图7同。

2.4SSP对小鼠B16细胞中酪氨酸酶活性的影响

从图6中可知:在样品处理3 d中,其测定结果显示,在一定浓度(25～75 μg/mL)范围内,随着样品组的浓度增大,SSP对酪氨酸酶的抑制作用逐渐增强,当SSP浓度增大到75 μg/mL,其抑制作用达到最大,继续增加SSP的浓度,其抑制作用有所降低,其中第1 d下降较为明显,到第3 d时下降趋势较为平缓。可能原因是在第3 d时细胞存活率相对降低,且营养状况及细胞周围的环境状况导致细胞的状态不好,从而使得各浓度间的酪氨酸酶活性差距较小。图6中还可知:同一浓度条件下,随着作用时间延长,其对细胞中酪氨酸酶活性的抑制作用增加,可能是由于时间延长,细胞数量相对增多,细胞内产生的酪氨酸酶含量增加,SSP并未对细胞中酪氨酸酶作用达到饱和状态,从而能抑制更多细胞中酪氨酸酶的活性,使得相对的测定酪氨酸酶活性降低。这说明了SSP不仅能在体外抑制酪氨酸酶的活性(图4),还能透过细胞抑制细胞内酪氨酸酶活性。Chan[11]等研究发现细胞内酪氨酸酶的活性测定比体外酪氨酸酶活性测定可靠性更高。因此在细胞中对酪氨酸酶的测定更能说明SSP能够透过细胞,抑制酪氨酸酶活性。范成成[27]从文蛤里分离得到一种多肽Mer1对酪氨酸酶有很好抑制作用,且对细胞无毒害作用。目前的研究显示SSP作为天然来源的生物活性肽,不添加任何刺激性物质,纯天然,安全可靠,具有较好的应用前景。

图6　SSP和曲酸对小鼠B16黑色素瘤细胞中 酪氨酸酶活性的抑制作用Fig.6　Inhibition of kojic acid and SSP on tyrosinase activity in B16 melanoma cells

2.5SSP对小鼠B16细胞中黑色素含量的影响

从图7可知:作用1、2、3 d后,在一定浓度(25～125 μg/mL)范围内,随着SSP浓度增大,其对细胞中黑色素生成的抑制作用逐渐增强,细胞中黑色素含量降低。且同一浓度条件下,随着时间天数的增加,其抑制作用呈上升趋势。可能是由于时间延长,细胞数量相对增多,细胞内产生的黑色素含量增加,而整体黑色素含量并不多,故在SSP浓度充足的条件下,其能够充分的作用于细胞,从而使细胞中黑色素含量在小幅度范围内降低。CANUN等[28]人将HQ和EGFP与11-聚谷氨酸融合后,采用经皮注射的方法测定融合物是否能进入表皮细胞来抑制黑色素的生成。MARINI等[29]进一步研究了四肽PKEK在体内(人脸部及背部)对黑色素的抑制作用。因此选择测定细胞中黑色素含量更能证明其具有美白的功效。

图7　SSP和曲酸对小鼠B16黑色素瘤细胞中 黑色素含量的抑制作用Fig.7　Inbition of SSP and kojic acid on cellular melanin content in B16 melanoma cells

黑色素的含量直接决定了皮肤的白皙程度,目前,公认的黑色素形成的过程[30]大致为酪氨酸在酪氨酸酶的作用下氧化成多巴,多巴氧化形成多巴醌,多巴醌再经过一系列的反应,最后形成真黑素。其中酪氨酸酶是黑色素形成的关键酶[31]。因此本研究通过在生化水平上测定其对酪氨酸的抑制作用之后,进一步在细胞水平上验证SSP能够透过细胞作用于细胞中的酪氨酸酶,并测定其对细胞中黑色素生成的抑制作用,以上实验结果(图5～图7)表明SSP对细胞无毒害作用,并且能够透过细胞,抑制细胞中的酪氨酸酶活性及黑色素的生成。因此,皮肤美白剂可以通过抑制酪氨酸酶活性,从而减少黑色素的生成,达到美白皮肤的效果[32]。

3　结论

通过酶法水解和膜分离技术等工序,从远东拟沙丁鱼制备低分子量的蛋白多肽是具有可行性的。得到的远东拟沙丁鱼蛋白多肽重均分子量为1664 u,分子量在500～3000 u之间,约占75%。该蛋白多肽无论在生化水平和细胞水平上都能抑制酪氨酸酶的活性,并在细胞水平上能够抑制黑色素的生成。因此SSP能够作为一种酪氨酸酶抑制剂广泛应用于美白化妆品及医药品行业。

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Preparation of polypeptide fromSardinopssagaxand its tyrosinase inhibition activities

LI Ya-hui1,JI Wei1,JI Hong-wu1,2,3,*,SU Wei-ming1,2,WANG Jing-jing1

(1.College of Food Science and Technology,Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524088,China;2.Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic Products of Guangdong Higher Education Institution,Zhanjiang 524088,China;3.Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Product Processing and Safety,Zhanjiang 524088,China)

The polypeptide was prepared from theSardinopssagaxbythrough hydrolysing by animal proteolytic enzymes and flavor enzyme and ultrafiltration separation. The molecular weight distribution of the polypeptide obtained was determined by HPLC. With tyrosinase inhibition rate on the biochemical level and tyrosinase activity and melanin content in B16 cells on cell level as indexs,the effects of SSP on tyrosinase activity and the content of melanin were investigated. The results showed that average molecular mass of SSP was 1664 u,the range of which was mainly from 500 u to 3000 u.Both in the biochemical level and cellular level,SSP can inhibit tyrosinaseavticity and the content of melanin in B16 cell.With the function of whitening,SSP was expected to be a non-toxic nature tyrosinaseinhibitor. There were good potentials for SSP application in pharmaceutical,foods and cosmetic.

Sardinopssagax;polypeptide;tyrosinase activity;melanin content

2015-06-08

李亚会(1989-)，女，硕士研究生，研究方向：水产品深加工及贮藏工程，E-mail:13058369058@163.com。

吉宏武(1962-)，男，博士，教授，从事海洋生物资源高值化利用研究,E-mail:Jihw62318@163.com。

广东省高等学校学科建设专项资金资助项目(2013CXZDA020)；广东省省部产学研合作专项资金项目( 2013B090600155)；国家海洋公益性行业科研专项课题 (201305018)。

TS254.1

A

1002-0306(2016)03-0058-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.003