培养基配方对冬虫夏草菌株产生粉红异变的影响研究

张宗豪，李玉玲（青海大学畜牧兽医科学院，西宁810016）

培养基配方对冬虫夏草菌株产生粉红异变的影响研究

张宗豪，李玉玲*
（青海大学畜牧兽医科学院，西宁810016）

冬虫夏草真菌筛选过程中，蝙蝠蛾拟青霉SH-1的菌丝会逐渐产生粉红色变化，SH-1和粉红菌株ZH-1在形态上存在很大差异，经分子鉴定，两株菌为同一种。为查明产生粉红菌株的原因，最大化粉红菌株的得率，在考察4个培养基配方因素对粉红菌株产生的的单因素试验基础上，通过响应面法中的BBD设计优化冬虫夏草培养基配方，分析影响菌株SH-1产生粉色变化的因素。结果表明：产生ZH-1最适的培养基配方为氮源A（x1）43.51 mL，K2HPO4（x2）0.6g、氮源B（x3）2.56g、葡萄糖（x4）5.18g。在此培养基配方条件下，菌株ZH-1产生概率为37.24%。试验结果表明，培养基配方中氮源A、K2HPO4的含量对产生粉红现象有显著影响，氮源A、葡萄糖含量对粉红菌株ZH-1的得率有显著影响。

响应面法；冬虫夏草菌株；培养基配方；粉红变化；产生概率；得率

冬虫夏草［Cordycepssinensis（BerK.）Sacc.］属真菌界（Fungi）子囊菌纲（Asocmycotetes）肉座菌目（Clavicipitales）麦角菌科（Clvaieipiacteae）冬虫夏草属（Cordyceps）的冬虫夏草菌（Cordycepssinenss）寄生在蝙蝠娥科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体［1］，《中华人民共和国药典》对其功用的描述是：“补肺益肾，止血化痰。用于久咳虚喘，阳痿遗精，腰膝酸痛”。冬虫夏草主要分布在我国青海、西藏、四川、甘肃等海拔3 000—5 000 m的部分地区，冬虫夏草是主产区群众经济财源的重要组成部分［2］。近年来冬虫夏草采挖严重过度，使冬虫夏草野生资源濒临枯竭，野生冬虫夏草生产面积正在逐年缩小，产量也随之下降［3］。

冬虫夏草人工培育的菌丝体成份、含量与天然冬虫夏草非常相似，是天然冬虫夏草最适替代品［4］。在本实验室静止培育冬虫夏草菌株SH-1的过程中，发现部分培养瓶内菌丝体生长到一定时期，从中间开始转化成粉红色，逐步蔓延到瓶壁，原先的粗糙表面变成有张力、有韧性的光滑表面，富含水分，周围又形成多层毛刺状结构。随着生长瓶内培养物逐渐形成一个整体，周围与瓶壁紧密结合，培养物颜色鲜艳，整体呈果冻状。将产生变化后的粉红色菌株编号为ZH-1。

图1　菌株SH-1和粉红菌株　ZH-1Fig.1　Comparison ofstrainsH-1 and pinkstrain ZH-1

菌株SH-1与粉红菌株ZH-1的ITS序列比对鉴定中发现，11株SH-1和2株ZH-1都能扩增出条带，条带清晰且稳定，13株菌株在Genbank中应用Blast比对，与Paecilomycessp.Cs-4（EU328187）的相似性达到了100%，用三种方法（邻位相连法、最大可能性法、最大简约性法）对13株菌株ITS序列与分离自冬虫夏草的32株真菌ITS序列（下载自Genbank）构建系统进化树，三种方法都显示13株菌与蝙蝠蛾拟青霉分为一支，可以确定粉红菌ZH-1与正常菌株SH-1为同一个种，即蝙蝠蛾拟青霉。

粉红色变化影响到了SH-1的正常生长，为了查明产生的原因，本试验针对培养过程中与菌株生长有直接关系的培养基配方进行研究，利用响应面法寻找配方组合对粉红菌株产生的影响。Box-Behnken设计结合响应面法是通过采用多元线性拟合或二项式回归分析来表达因素与响应值之间函数关系的一种统计方法［5］，且可以明确任意两个因素的交互作用影响，结果直观、可靠，且试验效果好。

本研究在单因素试验的基础上选择氮源A、K2HPO4、氮源B、葡萄糖4个主要因素（为了保密培养基配方，两种氮源标记为：氮源A与氮源B），考察了4个因素对粉红菌株ZH-1产生概率和得率和SH-1得率的影响，对影响粉红菌株产生概率和得率的配方因素进行了优化，以期找出适合粉红菌株生长的最适配方条件，为下一步阐明两个菌株之间的关系和初步探讨产生的机理提供数据支持和理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

供试菌种：冬虫夏草菌由青海省畜牧兽医科学院纯化培养，编号为SH-1，经中科院微生物研究所鉴定为蝙蝠蛾拟青霉，保存于本研究室。

主要仪器：组培瓶、高压灭菌锅、超净工作台、多功能光照培养箱、FA1004电子分析天平。

分离用固体培养基（改良PDA培养基）：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15—20g，自来水1 000 mL，自然pH，添加3g牛肉膏。

培养用液体培养基：每200 mL溶液中，土豆20g、胡萝卜10g、氮源A 40 mL、氮源B 5g、葡萄糖8g、MgSO40.1g、K2HPO40.4g。

1.2试验方法

1.2.1培养条件

冬虫夏草菌液体培养条件设定为：500 mL的培养瓶中，培养液200 mL、接种量为10 mL、pH 5.8，培养温度为20℃，光照条件为自然光照，培养时间为60d。单因素试验每个处理134瓶，重复3次。响应面试验每个处理20瓶，重复3次。

1.2.2菌丝体生物量的测定

每个处理菌丝体在生长到60d以后，收集已长成菌块的菌丝体，用蒸馏水洗涤3次，60℃条件下干燥至恒重，测定即为菌丝体干重。

1.2.3产生概率和得率的计算

式中：M为收取的菌丝体干重（g），V为平均装液量（mL）。

1.2.4单因素和响应面法试验设计

由单因素试验考察氮源A、氮源B、K2HPO4、葡萄糖对粉红菌株产生的影响，再通过4因素3水平的响应面试验结果，确定产生粉红菌株的最适配方条件以及影响SH-1与ZH-1得率的最适配方条件。试验因素与水平设计见表1。

表1　试验因素与水平设计表Table 1　Liner equations and factors of four formula components

1.2.5数据处理

利用EXCEL 2007软件进行数据整理，SPSS 19.0软件进行单因素方差分析，Design-expert 8.0软件进行响应面法分析。

2　结果与分析

2.1冬虫夏草菌培养基配方单因素试验

2.1.1氮源A对产生粉红菌株的影响

固定氮源B 5g、葡萄糖8g、K2HPO40.5g，选择氮源A含量分别为20 mL、40 mL、60 mL、80 mL进行试验，结果见图2、图3。

图2　不同氮源A含量对SH-1产生　ZH-1变化概率的影响Fig.2　Effects ofdifferent nitrogensource A content on fungi change probability ofsH-1 to ZH-1

图3　不同氮源A含量对SH-1和ZH-1得率的影响Fig.3　Effects ofdifferent nitrogensource A content on fungi yield ofsH-1 and ZH-1

由图2可知，在氮源A含量为40 mL时SH-1产生ZH-1的变化概率最大，图3显示，随着氮源A含量的增加，ZH-1的得率也在增加，在60 mL时的得率与20 mL、40 mL时有显著差异，与80 mL没有显著差异。SH-1的得率也随着氮源A含量的增加而增加，并且每个梯度都有显著差异，因此，综合考虑到粉红色变化概率和ZH-1的得率，选择氮源A含量为40 mL为宜。

2.1.2K2HPO4对粉红菌株产生的影响

固定氮源A 40 mL、氮源B 5g、葡萄糖8g、，选择K2HPO4含量分别为0.2g、0.4g、0.6g、0.8g、1.0g进行试验，结果见图4和图5。

图4　不同　K2HPO4含量对SH-1产生　ZH-1变化概率的影响Fig.3　Effects ofdifferent K2HPO4content on fungi change probability ofsH-1 to ZH-1

图　5 不同　K2HPO4含量对SH-1和ZH-1得率的影响Fig.4　Effects ofdifferent K2HPO4content on fungi yield ofsH-1 and ZH-1

由图4可知，在K2HPO4含量为0.4g时SH-1产生ZH-1的变化概率最大，图5显示，随着K2HPO4含量的增加，ZH-1的得率先增加后减小，得率差异不显著。SH-1的得率随着K2HPO4含量的增加有所增加，得率差异也不显著，因此，选择K2HPO4含量为0.4g为宜。

2.1.3氮源B对粉红菌株产生的影响

固定氮源A 40 mL、K2HPO40.4g、葡萄糖8g、，选择氮源B含量分别为1g、2g、3g、4g、5g进行试验，结果见图6、图7。

图6　不同氮源B含量对SH-1产生ZH-1变化概率的影响Fig.6　Effects ofdifferent nitrogensource B content on fungi change probability ofsH-1 to ZH-1

图7　不同氮源B含量对SH-1和ZH-1得率的影响Fig.7　Effects ofdifferent nitrogen source B content on fungi yield of SH-1 and ZH-1

由图6可知，在氮源B含量为2g时SH-1产生ZH-1的变化概率最大，图7显示，随着氮源B含量的增加，ZH-1和SH-1的得率也随之增加，并且每个梯度都有显著差异，因此，选择氮源B含量为2g为宜。

2.1.4葡萄糖对粉红菌株产生的影响

固定氮源A 40 mL、K2HPO4含量0.4g、氮源B 5g，选择葡萄糖含量分别为2g、4g、6g、8g、10g进行试验，结果见图8、图9。

由图8可知，在葡萄糖含量为4g时SH-1产生ZH-1的变化概率最大，图9显示，随着葡萄糖含量的增加，ZH-1和SH-1的得率也先增后减，ZH-1在葡萄糖含量为6g时出现最大值，与其他梯度相比，差异显著，而SH-1在葡萄糖含量为8g时出现最大值。因此，选择葡萄糖含量为6g为宜。

2.2响应面法试验结果

通过上述的单因素分析，我们筛选出了氮源A（x1）、K2HPO4（x2）、氮源B（x）、葡萄糖（x4）4个主要因素，采用Box-Behnken设计结合响应面法，以菌株SH-1变化为菌株ZH-1概率和ZH-1的得率为响应值，考察影响产生粉红菌株的培养基配方因素，试验结果见表2。

图8　不同葡萄糖含量对SH-1产生　ZH-1变化概率的影响Fig.8　Effects ofdifferentglucose content on fungi change probability ofsH-1 to ZH-1

图9　不同葡萄糖含量对SH-1和ZH-1得率的影响Fig.9　Effects ofdifferentglucose content on fungi yield ofsH-1 and ZH-1

表2　试验设计与结果（n=4）Table 2　Optimization of extraction condition and Results of experiment（n=4）

表3　配方条件对粉红菌株ZH-1产生概率与得率模型方差分析结果Table 3　The model variance analysis results of change probability and fungi yield ofstrain ZH-1

根据表3中回归模型的方差分析可知，模型1的F=66.99，P＜0.0001，模型2的F=222.52，P＜0.0001，说明本试验所选用的二次多项式模型具有高度的显著性。模型1的F失拟=0.291667，失拟项P= 0.9481＞0.05，模型2的F失拟=0.36095，失拟项P=0.9129＞0.05，失拟项均不显著，两个模型的决定系数R2值分别为0.9857和0.9955，说明两个模型能够解释98.57%和99.55%的响应值变化。因此，该模型拟合程度较好，可以用此模型来分析和预测菌株ZH-1的产生概率和得率。在总的作用因素中，回归方程一次项x1、x2、二次项和交互项对菌株ZH-1的产生概率均有较高的显著性，由F值的大小可以推断2个因素影响y1的排序为：x1＞x2；回归方程一次性x1、x4、二次项和交互项x1x3对菌株ZH-1的得率均有较高的显著性，由F值的大小可以推断2个因素影响菌株y2的排序为：x1＞x4。

试验所选用的四个因素，不仅影响到菌株SH-1产生菌株ZH-1的概率，而且对粉红菌株ZH-1得率有影响。分别以y1、y2为响应值，以x1、x2、x、x4为因变量，通过拟合可求出影响因素的一次效应、二次效应及其交互效应的关联方程，多元回归拟合分析如下。

产生粉红菌株ZH-1概率的二次方程模型为：

产生粉红菌株ZH-1得率的二次方程模型为：

2.3因素间的交互影响

根据拟合模型绘制菌株ZH-1产生概率及得率响应面的三维图与等高线，可直观地看出响应面的最高点，即参数范围内的极值以及因素间的相互作用对响应值的影响，依次可以确定最适培养基配方条件范围，Design-expert 8.0软件处理后三维响应面和等高线图（图10、图11）。

图10　菌株　ZH-1的产生概率模型的等高线及响应面图Fig.10　The model’s contour and responsesurface plot of change probability ofstrain ZH-1

图11　菌株　ZH-1的得率模型的等高线及响应面图Fig.11　The model’s contour and responsesurface plot of fungi yield ofstrain ZH-1

分析图10可知，氮源A（x1）、K2HPO4（x2）对菌株ZH-1产生概率的影响显著，表现为曲线较陡，即随着氮源A和K2HPO4的增加或减少，响应值变化较大，其他项影响较小，表现为曲线较为平滑，即随其他项的增加或减少，响应值变化较小。交互项中氮源A（x1）与氮源B（x3）、氮源A（x1）与葡萄糖（x4）、K2HPO4（x2）与氮源B（x3）、氮K2HPO4（x2）与葡萄糖（x4）的等高线图呈椭圆形，表明这些因素的交互作用对菌株ZH-1产生概率有显著影响。分析图11可知，氮源A（x1）、葡萄糖（x4）对菌株ZH-1的得率有显著的影响，其他项影响较小。交互项中氮源A（x1）与氮源B（x3）的交互作用对菌株ZH-1的得率有显著的影响，其他项有一定的交互作用，但作用不显著。

2.4菌株ZH-1产生概率及得率最适的配方条件

根据软件Design-expert 8.0对试验对试验结果进行最优化分析，得出了菌株ZH-1产生概率的最适配方条件为：氮源A（x1）43.51 mL，K2HPO4（x2）0.6g、氮源B（x3）2.56g、葡萄糖（x4）5.18g。在此培养基配方条件下，菌株ZH-1产生概率为37.24%；通过方程，得出了ZH-1的最大得率配方条件为氮源A（x1）60 mL，K2HPO4（x2）0.4g、氮源B（x3）2.11g、葡萄糖（x4）6.22g。菌株ZH-1得率可达到7.14%。

3　结论

本研究以SH-1转变为ZH-1的概率和ZH-1的得率为量化指标，从氮源A、K2HPO4、氮源B、葡萄糖4个因素的进行了单因素试验，在此基础上通过响应面法试验分析，建立了4个因素与产生菌株ZH-1概率、得率的数学模型，用响应面法确定培养基配方影响菌株SH-1产生菌株ZH-1的因素。试验表明，模型的回归效果显著，氮源A、K2HPO4可以作为预测菌株SH-1转变为菌株ZH-1的培养基配方因素。试验确定了产生粉红菌株ZH-1最适的培养基配方，为进一步确定菌株SH-1与粉红菌株ZH-1之间的关系提供数据参考，对粉红菌株的培养有一定的实际应用前景。

［1］梁宗琦.中国真菌志（第三十二卷）：冬虫夏草属［M］.北京：科学出版社，1991：9-10.

［2］中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志（第六十二卷）［M］.北京：科学出版社，1988：14.

［3］戴如琴，兰江丽，陈伟华，等.蝙蝠蛾拟青霉新种的研究［J］.北京农业大学学报，1989，15（2）：221-224.

［4］陈世江，钟国跃，马开森，等.珍稀名贵中药材冬虫夏草资源可持续利用的思考与建议［J］.重庆中草药研究，2006，（2）：8-10.

［5］罗信吕.冬虫夏草研究进展［J］.中国食用菌，2004，13（4）：3-5.

［6］刁治民.青海冬虫夏草资源及生物学特性的初步研究［J］.生物学杂志，1996，（2）：20-22.

［7］靳朝霞，杨少辉，李明刚，等.冬虫夏草的研究进展与发展趋势［J］.天津医科大学学报，2005，11（2）：137-140.

［8］刘连成，袁书林.响应面法优化北冬虫夏草液态发酵条件［J］.东北农业大学学报，2004，35（3）：325-326.

［9］王振忠，武文洁.野菊花总黄酮提取工艺的响应面设计优化［J］.时珍国医国药，2007，18（3）：648.

［10］刘华晶，许修宏，高士刚，等.不同培养基对北冬虫夏草生长的影响［J］.河南农业科学，2014，43（2）：142-146.

［11］巩泊梁，董冰雪，李长杰，等.响应面法优化蝙蝠蛾拟青霉发酵培养基配方［J］.微生物学免疫学进展，2011，39（4）：17-23.

［12］LIU C A，CHEN Q H，TANG B，et al.Responsesurface methodology for optimizing the fermentation medium of alpha-galactosidase insolidstate fermentation［J］.Letters in Applied Microbiology，2007，45：206-212.

［13］MONTGOMERYd C.Responsesurface methods and other approaches to process optimization.Design and Analysis of Experiments［M］.New York：John Wiley andsons，1997：427-510.

［14］姜文侠，孙武岳，马琳，等.蝙蝠蛾拟青霉菌丝体发酵的研究［J］.微生物学通报，1999，26（3）：192-194.

（责任编辑：张睿）

Effects of medium formula on Cordycepssinensis fungistrain emerging pink variation

ZHANG Zong-hao，LI Yu-ling*
（Animal and Veterinarysciences Academy of Qinghai University，Xining 810016，China）

A portion of fungistrainsH-1 wouldgradually change to pink colorduring thescreening process of Cordycepssinensis fungi.Although there was big morphologicaldifference betweenstrainsH-1 and pinkstrain ZH-1，molecular identificationshowed that the twostrains were thesamespecies.Forseeking the reason of emerging pink variation and obtaining the maximum yield of the pink fungi，four main factors including nitrogen A，K2HPO4，nitrogen B andglucose wereselected on the basis of experimental results ofsingle factors through responsesurface methodology.The optimum culture conditions were as follow：43.51 mL nitrogen A，0.6g K2HPO4，2.56g nitrogen B，5.18gglucose.Under the conditions，the optimum change probability of ZH-1 was 37.24%.The resultsshowed that the medium formula nitrogen A and K2HPO4had very important effects on ZH-1 appearing probability，nitrogen A andglucose had very important effect on ZH-1 yield.

Responsesurface method；Cordycepssinensis fungistrain；Medium formula；Change probability；Yield

S567.35

A

1000-3924（2016）04-035-07

2015-06-01

青海省科技厅国际合作项目“利用分子生物学开支青海冬虫夏草原产地保护质量评定研究”（2014-HZ-809）

张宗豪（1982—），男，硕士，助理研究员，主要从事草地微生物研究。E-mail：13897454181@163.com，Tel：13897454181

李玉玲（1969—），女，研究员，主要从事冬虫夏草研究。E-mail：Yulingli2000@163.com，Tel：0971-8562517