牛大力种子组培快繁技术研究

时 群， 陈丽文， 陈乃明， 何贵整， 杨利平， 梁 刚， 蔡 林

(广西钦州市林业科学研究所，广西钦州 535000)



牛大力种子组培快繁技术研究

时 群， 陈丽文， 陈乃明， 何贵整， 杨利平， 梁 刚， 蔡 林

(广西钦州市林业科学研究所，广西钦州 535000)

[目的]研究牛大力组织培养与快速繁殖技术。[方法]以牛大力种子为外植体，采用以芽繁芽途径，比较3种不同种源牛大力种子无菌发芽率、继代增殖、生根培养的表现差异。[结果]以MS+6-BA 0.4 mg/L+ NAA 0.2 mg/L为诱导培养基, 种子无菌发芽率分别为98.23%、92.13%和95.01%；以改良MS+6-BA 0.6 mg/L + IBA 0.3 mg/L+KT 0.2 mg/L为继代增殖培养基，添加半胱氨酸8 mg/L, FeSO4·7H2O加至MS用量的1.2倍， 增殖系数分别达5.57、3.20、5.30；以1/2MS+ NAA 1.0 mg/L+ IBA 1.5 mg/L、1/2MS+ NAA 1.0 mg/L+ IBA 3.0 mg/L、1/2MS+ NAA 1.5 mg/L+ IBA 1.0 mg/L为生根培养基，生根率分别达78.00%、67.33%、70.33%；生根苗移栽在V黄心土∶V细河沙∶V泥炭土=8∶1∶1基质中培育60 d后，成活率分别达94.00%、85.43%和89.97%。采用控根容器培育大苗，可实现育苗与种植同步。[结论]该研究为牛大力种苗快速繁殖及产业化生产提供科学依据。

牛大力；组织培养；种子；种源

牛大力(MillettiaspeciosaChamp.)为蝶形花科鸡血藤属药食两用植物，又名美丽崖豆藤、甜牛大力、扒山虎、大力薯、山莲藕，主治肺热、肺虚咳嗽、肺结核、风湿性关节炎、腰肌劳损、慢性支气管炎、慢性肝炎等[1-2]，是生产多种中成药的主要原料。其主产于我国广东、广西、海南和越南，不同牛大力种源叶片、花、果及薯的形态、长势表现各异[3-4]，根系穿透力强，辐射范围大[5]。近年来，随着市场需求与日剧增，对牛大力苗木繁殖技术研究也逐渐深入和全面，主要有播种育苗、扦插育苗和组培育苗[6-11]，组培育苗作为牛大力苗木规模化繁殖的有效方法之一，目前多采用幼嫩茎段为外值体，消毒较困难[12]，以种子为材料通过愈伤组织途径进行组培快繁已有研究[13],尚未见以种子为材料通过以芽繁芽途径进行牛大力组培快繁研究的报道。不同种源植株组织培养条件及培养基不同[14-16]，笔者以3种不同种源的牛大力种子为材料，采用无菌萌发芽苗带腋芽茎段为材料，建立以芽繁芽组培快繁体系，并采用控根容器培育大苗[17],可实现育苗与种植同步。

1　材料与方法

1.1材料试验所用牛大力种源分别来自广西钦州(Ⅰ)、广西上林(Ⅱ)、海南五指山(Ⅲ)，引进种植在钦州市林业科学研究所林地3年，采收成熟新鲜荚果种子。

1.3方法

1.3.1种子无菌萌发。11月至次年1月果实成熟时采收，分2种处理。处理①：当天剥开果壳，取出种子作为外植体，温开水冷至30 ℃浸泡4 h，在超净工作台上用75%乙醇浸泡5 s，再用0.1%HgCl2溶液消毒10 min，无菌水冲洗5次。在无菌条件下，点播在发芽培养基①上，每瓶点播1粒种子，接种40瓶，先暗培养7 d，选取获得的无菌种子，置于弱光下培养， 观察种子萌动时间，50 d后统计发芽率及每株腋芽数，重复3次；处理②：剥开果壳，取出种子，室内放置30 d，取种子消毒后点播在发芽培养基①上进行无菌萌发，同处理①。

1.3.2芽继代增殖培养。待种子萌发的无菌苗长至5～6 cm时，剪取上部约4 cm长带腋芽茎段，剪成2段，每段带2个腋芽，横放接种至培养基②～⑦上进行增殖培养，接种30瓶，重复3次，培养30 d观察芽生长情况并统计增殖系数。种子剪去部分根，保留约1 cm长的根，连同上部带1个腋芽的茎一起转至新配制的培养基中，继续诱导培养萌发新芽。

1.3.4炼苗移栽及幼苗管护。将生根组培苗在自然光下炼苗10～15 d，待小苗充分木质化，开盖2 d，喷水保湿，取出洗去培养基，移栽在3种不同基质中：黄心土(J1)、黄心土：细河沙(J2，体积比9∶1)、黄心土∶细河沙∶泥炭土(J3，体积比8∶1∶1)，用16cm×14cm的营养袋装好备用。移栽场所选在覆盖塑料薄膜及黑网的大棚内，棚内相对湿度保持在70%～90%，温度控制在30 ℃以下，交替喷施杀菌剂、叶面肥和复合肥，30 d后统计成活率。

1.3.5控根容器栽种。组培苗木移栽180 d后，待苗高20～50 cm，地径0.2 cm以上，叶片有5片以上即可出圃栽种至直径40 cm、高60 cm控根容器中，基质用黄心土∶细河沙∶泥炭土(体积比8∶1∶1)，用地布覆盖地面，栽种100株；另将组培苗栽种在大田中作为对照，株行距0.8 m×1.0 m。栽种时间达30 d时，每种栽培方式随机抽取10株，观察根生长情况。

1.4 数据处理采用DPS软件对以上各处理的3次重复数据进行统计，用Duncan法进行多重比较。

2　结果与分析

2.1种子放置时间对发芽率的影响 采集新鲜牛大力荚果，用当天剥开果壳的种子和放置30 d的种子作为外植体，消毒处理后接种在培养基①中进行无菌芽萌发，50 d统计种子发芽率，结果见表1。 从表1可以看出，采用当天剥开果壳取出的种子作为外植体，种子萌动时间10～12 d，比放置30 d的种子萌动时间早10 d左右；种子发芽率也较高，与同种源室内放置30 d的种子相比，种子发芽率差异显著；不同种源之间，种子发芽率无显著差异；当种子萌出的芽苗长至5～6 cm，每株芽苗段萌发的腋芽有7～8个可用于扩繁增殖。带1个腋芽的种子转至新配制的培养基中，继续诱导萌发2～5株丛生新芽，可重复2次，能为茎段增殖提供20～30个带腋芽茎段。

表1　种子放置时间对发芽率的影响

注：同列数据后不同大小写字母分别表示处理间差异极显著(P<0.01)和显著(P<0.05)。Ⅰ为广西钦州牛大力，Ⅱ为广西上林牛大力，Ⅲ为海南五指山牛大力。

Note: Data followed by different capital letters and lowercases in the same column stand for extremley significant and significant difference at 0.01 and 0.05 level.Ⅰ.M.Mspeciosa from Qinzhou,Guangxi,Ⅱ.Mspeciosa from shanglin,Guangxi,Ⅲ.M.speciosa from wuzhishan,Hainan.

2.2不同培养基对继代增殖的影响由表2可知，种子无菌苗带腋芽茎段经30 d增殖培养，不同种源牛大力种子无菌苗带腋芽茎段在不同培养基中生长情况不同，同种源牛大力在不同培养基中增殖系数差异极显著，均在⑦号培养基中表现最佳，继代增殖30 d，广西钦州牛大力增殖系数达5.57，广西上林牛大力增殖系数达3.20，海南五指山牛大力增殖系数达5.57，对培养基⑦中3种源牛大力种子无菌苗茎段增殖系数进行方差分析，结果表明，不同种源间差异极显著。

2.4不同基质对移栽成活率的影响由表4可知，不同基质对牛大力移栽成活率有较大影响，广西钦州、广西上林、海南五指山牛大力在J3基质中移栽成活率分别达94.00%、85.43%、89.97%，最高的是广西钦州牛大力；在J1基质中，移栽成活率较低，分别为77.03%、70.87%、72.10%；在J2基质中，移栽成活率比J1高，分别为84.57%、75.60%、80.43%，

表2　不同培养基对继代增殖的影响

注：同列数据后不同大小写字母分别表示处理间差异极显著(P<0.01)和显著(P<0.05)。Ⅰ为广西钦州牛大力，Ⅱ为广西上林牛大力，Ⅲ为海南五指山牛大力。

Note: Data followed by different capital letters and lowercases in the same column stand for extremley significant and significant difference at 0.01 and 0.05 level.Ⅰ.M.Mspeciosa from Qinzhou,Guangxi,Ⅱ.Mspeciosa from shanglin,Guangxi,Ⅲ.M.speciosa from wuzhishan,Hainan.

表3　 不同培养基对诱导生根的影响

注：同列数据后不同大小写字母分别表示处理间差异极显著(P<0.01)和显著(P<0.05)。Ⅰ为广西钦州牛大力，Ⅱ广西上林牛大力，Ⅲ海南五指山牛大力。

Note: Data followed by different capital letters and lowercases in the same column stand for extremley significant and significant difference at 0.01 and 0.05 level.Ⅰ.M.Mspeciosa from Qinzhou,Guangxi,Ⅱ.Mspeciosa from shanglin,Guangxi,Ⅲ.M.speciosa from wuzhishan,Hainan.

但苗木生长中少数叶逐渐变黄，生长缓慢。方差分析结果表明，不同种源牛大力移栽成活率和不同基质间移栽成活率达极显著水平。牛大力苗木在黏性强、通透性差的J1基质中，生长缓慢，移栽成活率低；在疏松的J2和 J3基质中，移栽成活率较高，增施有机肥泥炭土的J3基质中成活率最高，且苗木茎轴伸长，叶色翠绿。

表4 不同基质对移栽成活率的影响

Table 4 Effects of different transplanting medium on survival rate

%

注：同列数据后不同大小写字母分别表示处理间差异极显著(P<0.01)和显著(P<0.05)。Ⅰ为广西钦州牛大力、Ⅱ广西上林牛大力、Ⅲ海南五指山牛大力。

Note: Data followed by different capital letters and lowercases in the same column stand for extremley significant and significant difference at 0.01 and o.05 level.Ⅰ.M.Mspeciosa from Qinzhou,Guangxi,Ⅱ.Mspeciosa from shanglin,Guangxi,Ⅲ.M.speciosa from wuzhishan,Hainan.

2.5牛大力在控根容器中的生长情况由表5可知，与大田栽种相比，利用控根容器栽种的牛大力根数多，根总重量大，平均根长略短于大田栽种的牛大力。

3　 结论与讨论

3.1种子放置时间对发芽率的影响以牛大力种子作为外植体进行无菌萌发，解决了牛大力种子自然萌发时间长的问题，一粒种子通过重复诱导，能为继代繁殖提供20～30个无菌材料，保证以芽繁芽方式进行组培扩繁材料来源充足。3种源牛大力种子在无菌条件下，经室内培养，温度在25～28 ℃下均有较高的发芽率，与室外进行牛大力种子萌发特性研究一致[7]，当天剥开果壳的种子比放置30 d的种子萌动时间早、发芽率高。

3.2继代增殖存在的问题3种源牛大力种子无菌苗茎段在不同培养基中增殖系数和生长情况不同，均在改良MS+6-BA 0.6 mg/L+ IBA 0.3 mg/L+KT 0.2 mg/L+半胱氨酸8 mg/L +1.2倍FeSO4·7H2O用量(MS)培养基中表现最佳，在其他培养基中表现出一定缺陷:①芽玻璃化。③号培养基与②号培养基相比，对MS培养基进行了改良，降低了铵态氮浓度，提高了硝态氮含量，芽苗玻璃化减少；②褐化。④号培养基加入半胱氨酸，芽苗褐化消失；③茎基部产生异常愈伤组织。⑤号培养基将④号培养基中的生长素NAA改为IBA,茎基部产生异常愈伤组织减少，有利于芽苗生长；④无叶片分化。⑥号培养基在⑤号培养基的基础上加入KT,芽苗分化出的叶片增多；⑤叶黄白色。⑦号培养基在⑥号培养基的基础上加大FeSO4·7H2O用量后，芽苗叶片由黄白色转为翠绿色。通过不断优化MS培养基，有效解决了牛大力继代培养过程中存在的问题，促进芽苗分化复叶，叶片变绿，茎轴伸长、粗壮，保持芽苗3～5倍的增殖系数。

表5　牛大力在控根容器中及大田栽种生长情况

3.3生根培养基的筛选以1/2MS为基本培养基，附加不同浓度的生长素配比，3种源牛大力无菌芽苗在低浓度生长素配比 NAA 0.6 mg/L+ IBA 0.4 mg/L中，茎基部褐化，不生根。通过提高激素配比，无菌芽苗生根率提高，不同种源牛大力芽苗生根所需的NAA 和 IBA 浓度不同，添加的NAA浓度太大，茎基部形成膨大的愈伤组织，生根质量差。牛大力生根较困难，要提高生根质量，需进一步调试生根培养基。

3.4基质对移栽成活率的影响生根质量对移栽成活率有较大影响，茎基部膨大成愈伤组织，从愈伤组织中生出的根易断，移栽成活率低，直接从茎皮部生出的根不易断，移栽成活率高。不同基质对牛大力移栽成活率有较大影响，在疏松的黄心土、细河沙、泥炭土混合基质中移栽成活率高，在黏性强、易板结、通透性差的黄心土中栽成活率低。

3.5牛大力在控根容器中根生长情况 利用控根容器栽种的一年生牛大力根短而粗，根数多，根总重量大。由于牛大力的根系穿透力强，辐射范围大，采收时挖掘的人力成本大，利用控根容器培育大苗及栽种，扭开螺钉即可观测及采收，达到既省工又高产的效果，对2年及多年生牛大力的根生长情况有待进一步观察。

[1] 广西壮族自治区卫生厅.广西中药材标准(1990年版)[S].南宁:广西科学技术出版社,1992.

[2] 全国中草药汇编编写组.全国中草药汇编：上册[M].3版.北京：人民卫生出版社,1986:200.

[3] 段左俊,曾祥全,陈飞飞,等.牛大力的品种选育试验研究[J].热带林业,2014,42(4):15-18.

[4] 段左俊,曾祥全,陈飞飞,等.牛大力的生物学特性及其栽培管理[J].热带林业,2011,39(4):22-25.

[5] 段左俊,赵俊忠,曾祥全,等.牛大力的套种模式研究[J].热带林业,2013,41(2):14-18.

[6] 黄秋银,胡东南,陈述富,等.牛大力种子发芽研究[J].安徽农业科学,2009,37(34):16845-16846.

[7] 姚绍嫦,白隆华.牛大力种子萌发特性研究[J].种子，2012,31(8):36-38.

[8] 段左俊,曾祥全,陈飞飞,等.牛大力扦插繁育试验[J].热带林业,2013,41(4):9-13.

[9] 潘颖南,张向军,蒙平,等.药用植物牛大力组织培养初探[J].广西农业科学,2010,41(6):523-525.

[10] 黄碧兰,徐立,李志英,等.牛大力茎段组织培养技术研究[J].安徽农业科学,2008,36(32):13993-13994.

[11] 韦鹏霄,李冬萍,岑秀芬,等.外源激素对牛大力无菌芽增殖的影响[J].岳阳职业技术学院学报,2013,28(4):80-85.

[12] 时群,韦大器,陈丽文,等.牛大力茎段组织培养污染率控制方法的初步研究[J].广西中医学院学报,2007,10(3):63-64.

[13] 王祝年,李志英,徐立,等.牛大力的组织培养和快速繁殖[J].植物生理学通讯,2005,41(6):800.

[14] 王静华,候建生,刘桂林.等.两种不同种源地白榆的组织培养与叶片再生研究[J].中国农学通报,2009,25(5):110-115.

[15] 刘涛,张雪梅,赵银河.大花蕙兰种子组织培养条件的探索[J].种子,2014,33(3):86-88.

[16] 李荣珍.铁皮石斛种子试管苗的快速繁殖研究[J].广东农业科学,2012,39(14):22-24.

[17] 玄成龙,李冬梅,刑建军,等.控根容器栽培对田樱桃生长发育的影响[J].现代农业科技,2011(15):112-114.

Study on Tissue culture and Rapid Prapagation ofMillettiaspeciosaSeeds

SHI Qun, CHEN Li-wen, CHEN Nai-ming et al

(Qinzhou Forestry Research Institute, Qinzhou, Guangxi 535000)

[Objective] The aim was to research the tissue culture and rapid propagation ofMillettiaspeciosa. [Method] UsingM.speciosaseeds as explant, the seeds germination rate, the proliferation coefficient, the rooting rate ofM.speciosafrom three provenances were compared. [Result] The results showed that the seeds germination rate was 98.23%, 92.13% and 95.01% respectively under sterile condition in medium of MS+6-BA 0.4 mg/L+ NAA 0.2 mg/L, the proliferation coefficient was 5.57, 3.20 and 5.30 respectively in medium of modified MS+6-BA 0.6 mg/L + IBA 0.3 mg/L+KT 0.2 mg/L, added with cysteine 8 mg/L and 1.2 times of FeSO4·7H2O to MS, the rooting rate was 78.00%, 67.33% and 70.33% respectively in medium of 1/2MS+ NAA 1.0 mg/L+ IBA 1.5 mg/L,1/2MS+ NAA 1.0 mg/L+ IBA 3.0 mg/L and 1/2MS+ NAA 1.5 mg/L+ IBA 1.0 mg/L, and the transplanting survival rate was 94.00%, 85.43% and 89.97% respectively on yellow subsoil, fine sand and peat soil at the rate of 8∶1∶1. The root controlling container seedlings cultivation, breeding and planting can achieve synchroniaztion. [Conclusion] The research can provide the scientific basis for seedling rapid propagation and industrial production ofM.speciosa.

MillettiaspeciosaChamp.; Tissue culture; Seed; Provenances

钦州市科学研究与技术开发计划项目(20143002)。

时群(1970- )，女，广西全州人，高级工程师，从事植物生物技术研究与推广应用工作。

2016-05-20

S 188

A

0517-6611(2016)21-138-04