基于高通量测序分析老面细菌多样性

张海燕,柳陈坚,刘祥祥,罗义勇,李晓然

(昆明理工大学生命科学与技术学院,云南昆明 650500)



基于高通量测序分析老面细菌多样性

张海燕,柳陈坚+,刘祥祥,罗义勇,李晓然*

(昆明理工大学生命科学与技术学院,云南昆明 650500)

老面中微生物组成多样，带来多种微生物的发酵产物及风味，分析老面中细菌群落多样性对于开发优良面食发酵剂提供有用信息。本研究采用基于16S rDNA的焦磷酸测序方法分析了采集自云南省香格里拉县的三个老面样品中细菌群落结构。结果表明，三个样品细菌多样性都比较高，17年和2年老面中，优势菌是Lactobacillussanfranciscensis，2年老面中含有少数序列与L.rossiae和L.plantarum具有较高的相似性，而5年老面中优势菌是Staphylococcusequorum，其次是L.sanfranciscensis。结论：老面中细菌多样性较高，以乳酸菌为主，其中的乳酸杆菌为老面发酵面食带来丰富的营养和风味物质，但是较高丰度葡萄球菌属的检出，暗示了一定的食品安全隐患。

老面,细菌群落,焦磷酸测序,多样性

老面是制作发酵面食的发酵剂,将水和面粉等原料按一定的比例混合,自然发酵而成,每次发酵后保留部分面团作为下次发酵的发酵剂。比起市售的单一酵母发酵剂,老面发挥了多菌种混合发酵的优势,多种微生物混合发酵改善了面食中的营养成分,生成醇、脂、醛、酚等多种风味物质[1]。采用老面发酵蒸制出的馒头、包子等面食,质构松软,香甜可口,风味独特,深受消费者喜爱。

工业化生产的发酵面食主要采用单一酵母发酵剂和泡打粉等食品添加剂制作而成。老面中的微生物主要是乳酸菌和酵母菌,乳酸菌在面团发酵过程中产生有机酸等物质决定发酵面食的口感和风味,同时有机酸可以抑制病原微生物生长,延长发酵面食的保质期。以前对老面微生物的研究大多采用富集分离纯培养与鉴定的方法[2-3],虽然也获得了一些有用的信息,但是通过培养方法仅能得到样品中少部分微生物信息,给充分发掘与利用传统发酵剂菌种资源带来一定困难。基于PCR的分子生物学方法对依赖培养的技术进行了补充,随着测序技术的快速发展,能够得到更多的序列信息,极大地促进了对复杂微生物群落多样性的研究[4]。

老面中的微生物菌群结构是保障发酵面食产品质量的前提与基础,其中除了市售发酵剂提供的酵母外,乳酸菌也起到极为重要的作用,因此,本研究旨在分析老面中细菌群落结构,明确其中的益生菌及潜在致病菌。本研究以云南省迪庆州香格里拉县三个不同年份的老面为研究对象,分别为持续使用17年、5年和2年的老面样品,采用焦磷酸高通量测序的方法对三个老面样品中的细菌群落多样性进行研究,以期为传统发酵面食安全提供有利的信息,为筛选出适合作为面食发酵剂的优良菌株组合提供参考依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

实验用的老面样品分别购于云南省迪庆自治州香格里拉县农贸市场的三个不同的商铺,均为自然发酵老面,购买后分别装入无菌采集袋中,置于便携式冰箱中运送至实验室,并于-80 ℃保存备用。三个老面分别为反复使用17年、5年和2年的老面样品,即每次制作发酵面食后留下一些发酵面团作为下一次面食的发酵剂,如此反复使用,分别命名为LM17,LM5,以及LM2。

DNA提取裂解缓冲液:0.1 mol/L Tris/HCl,0.1 mol/L EDTA,0.75 mol/L蔗糖;TE缓冲液:10 mmol/L Tris-HCl(pH8.0),1 mmol/L EDTA(pH8.0);Premix Ex TaqTM大连TaKaRa公司。

DNA纯化回收试剂盒QIAquick Gel Extraction Kit德国Qiangen;Sigma 3-18K离心机美国Sigma公司;Labnet 230V EU涡旋仪美国labnet公司;ABI 7200PCR仪美国ABI公司;Nanodrop ND-1000分光光度计美国Thermo公司;罗氏GS-FLX测序仪瑞士Roche公司。

1.2实验方法

1.2.1DNA提取DNA提取参考Schmidt等[5]的方法并做了适当的修改。为了较为全面地分析样品中的微生物,对样品采用直接提取DNA的方法。在实验室无菌操作台上,各采集5份老面表面(不同部位)和5份内部(不同部位)的样品,样品混匀后,取约0.2 g老面样品于2.0 mL的离心管中(为增加得到的DNA量,DNA提取在多个离心管中进行,最后混合),加入450 μL裂解缓冲液和10 μL 50 mg/mL溶菌酶,37 ℃水浴30 min。往离心管中加入25 μL 20% SDS和5 μL 20 mg/mL蛋白酶K,震荡混匀后,55 ℃水浴2 h以上。随后加入80 μL 5 mol/L NaCl和60 μL 10% CTAB/NaCl,小心混匀后,65 ℃水浴20 min。加入等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1,体积比),约700 μL,颠倒混匀后,12000 r/min离心10 min。小心取上清至新的1.5 mL离心管中,加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1,体积比),颠倒混匀后,12000 r/min离心10 min。小心取上清至新的1.5 mL离心管中,加0.6倍体积的异丙醇,-20 ℃沉淀过夜。随后,12000 r/min离心15 min,弃上清,加500 μL 70%乙醇(-20 ℃预冷)洗涤沉淀,12000 r/min离心15 min,弃上清,65 ℃烘干30 min(每隔10 min轻弹管壁,以促进液体挥发),最后,加40 μL TE缓冲液溶解DNA,并将其于-20 ℃冰箱中保存备用。

1.2.2细菌16S rDNA扩增和焦磷酸测序使用16S rDNA通用引物338F(5′-ACH YCT ACG GGA GGC HGC-3′)和907R(5′-CCG TCA ATT CMTTTG AGT TT-3′)对细菌DNA的V3-V5高变区进行扩增。为了减少PCR过程中产生过多的非特异性扩增的异源双链DNA,将PCR产物稀释10倍作为模板后按照原来的条件再做5个循环[6]。PCR扩增采用Premix Ex TaqTM(大连TaKaRa公司),具体体系及程序如下:

PCR反应体系:ddH2O 18 μL;Forward引物(5 μmol/L)2 μL;Reverse引物(5 μmol/L)2 μL;25 μL Premix Ex TaqTM;模板3 μL(15 ng);总体积50 μL。

PCR扩增程序:95 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min;56 ℃复性1 min;72 ℃延伸1 min;共30个循环。最后72 ℃延伸10 min。

将PCR产物在1%(wt/vol)的琼脂糖凝胶中电泳,电泳结束后,将凝胶浸泡于TAE缓冲液(含20 μg/mL的EB)中10 min,随后在216 nm紫外灯下呈现橙色条带。将目的条带割下,并选用DNA纯化回收试剂盒对PCR产物进行纯化回收。使用分光光度计对已纯化的PCR扩增产物进行定量。使用罗氏测序系统对DNA进行测序。

1.2.3测序结果分类鉴定将焦磷酸测序后所得序列,根据barcode分配到对应的样品中,并去除barcode和引物序列,去掉含有“N”的序列,同时对序列长度进行筛选,仅保留长度大于400 bp的序列,得到有效的序列文件。使用mothur v1.25.1[7]的classify.seqs命令,采用Silva的核糖体小亚基(SSU)rRNA序列数据库V102的分类信息,得到序列的分类信息。

1.2.4多样性指数和系统发育分析使用mothur v1.25.1[7]对老面样品中细菌的多样性指数进行分析,以0.03为cutoff值划分可操作分类单元(Operational taxonomic unit,OTU),计算样品的多样性指数(Chao1和ACE值),并绘制稀释(rarefaction)曲线。细菌的16S rDNA在样品中的覆盖度(Coverage),根据序列中的Singleton(只有一条序列的OTU),用公式C=[1-(n1/N)]×100来计算。其中,n1代表singleton的数量,N则表示总序列数。确定用于构建细菌系统发育树的OTU数目,并从中各选取一条代表性序列,将其与NCBI的GenBank中的序列进行Blast比对,随后将结果中具有确定分类信息的序列用ClustalX 1.83[8]进行比对,再将比对的结果用Mega v4.0[9]中的Neighbour-joining[10]方法构建系统发育树。

2　结果与讨论

2.1序列信息和多样性指数

对焦磷酸高通量测序的结果进行分析,根据添加的barcode将序列分类到三个样品中,去掉含有“N”的序列及其他低质量的序列,保留长度在400 bp以上的序列,去除序列里的嵌合体(Removing chimeras),最终,LM17,LM5,以及LM2三个样品分别得到552,595和2010条细菌序列用于后续分析(表1)。样品LM5中,OTU数目和细菌群落的多样性均高于LM17和LM2。样品中细菌的稀释曲线如图1所示,在cutoff为0.03时,曲线未达到平台期,呈现上升的趋势,但是,样品LM17和LM2的覆盖度仍达到了90%以上,可见基于本实验的测序深度尽管会忽略样品中某些含量较少的微生物群落(rare biosphere),但在老面制作过程中发挥主要作用的微生物均已得到分析。老面制作过程中的主要微生物为乳酸菌[11-12],在样品LM17和LM2中,在科和属的分类水平上,乳酸菌都是其中的优势微生物,而样品LM5可能在其制作过程中因环境因素等的影响,受到了葡萄球菌的污染,乳酸菌成为其中的第二优势微生物(图3)。

表1　基于16S rDNA序列相似度为97%的细菌丰度Table 1　Bacterial richness based on the 16S rDNA sequence similarity of 97%

图1　基于16S rDNA序列相似度为97%的 rarefaction方法估计老面样品中细菌多样性Fig.1　Estimated sourdough bacterial community diversity, according to the rarefaction method,depending on the 16S rDNA sequence similarity of 97%

利用韦恩图(Venn diagram)进一步研究三个老面样品中细菌群落结构关系(图2)。结果显示,三个老面样品中共有的OTU类型数量为1,占总序列数的9%,对该OTU进行分类分析可知,属于旧金山乳杆菌(Lactobacillussanfranciscensis)。除此之外,样品LM17和样品LM2中还含有松鼠葡萄球菌(Staphylococcussciuri)。虽然三个老面样品均包含其特有的OTU类型,但它们在总序列数中所占的比例均较低。

图2　三个老面样品中共有OTU分析图Fig.2　Venn diagram showing the shared OTUs in the three traditional sourdoughs

2.2细菌群落多样性

图3　三个老面中细菌在不同分类水平的分布Fig.3　The major families and genera in fermented sourdough

根据Silva的SSU rRNA序列数据库对获得的序列进行分类,三个老面样品中的细菌群落结构的组成存在着差异,尤其是LM5样品与其余两个样品在科与属的分类水平上差异显著。图3展示的是三个老面样品在科和属水平上的分布情况。在LM17样品中,共检测到了3个细菌门的序列,其中有10%的序列属于蓝藻门(Cyanobacteria),经分析,这些序列是属于叶绿体的,叶绿体的出现可能是由老面店铺堆放的蔬菜引起的,这也从一个侧面反映出老面制作环境影响着其中微生物菌群的组成。为了排除干扰,删除属于叶绿体的序列后,占总序列99%的序列属于厚壁菌门(Firmicutes)。Ercolini等[11]采用基于16S rDNA的焦磷酸高通量测序技术分析老面样品中的微生物群落结构,厚壁菌门也同样是其中主要的优势门。在厚壁菌门中,序列可以分为7个科,其中属于乳杆菌科(Lactobacillaceae)的序列占总序列的89%,其他属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae),葡萄球菌科(Staphylococcaceae),肉杆菌科(Carnobacteriaceae)等的序列,占总序列的比例均不足1%。在属这一分类水平上,总序列中64%的序列都属于乳杆菌属(Lactobacillus),乳杆菌属作为乳酸菌中最大的一个属,其在人和动物胃肠道微生态平衡中起着重要的作用,也是乳制品发酵剂以及益生菌产品的主要菌株,Zhang等[12]通过对5个老面中的微生物群落结构进行系统进化分析,同样得出乳杆菌属是老面中主要的优势属。

图4　细菌的系统发育树 Fig.4　Phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequences and their phylogenetic relationships

LM5样品中的细菌组成比较复杂,虽然仅检测到了4个门,序列所占比例较高的是厚壁菌门(94%)和变形菌门(Proteobacteria)(5%),但是在科和属的水平上,LM5样品明显不同于其他两个样品,分别检测到了13个科和25个属。在科的分类水平上,优势科是葡萄球菌科(Staphylococcaceae)(43%),其次是乳杆菌科(20%)、肉杆菌科(Carnobacteriaceae)(12%)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)(3%)等。在属的分类水平上,葡萄球菌属(Staphylococcus)(41%)是最主要的优势属,此外,占总序列的6%,4%,3%和2%的序列分别属于副乳杆菌属(Paralactobacillus)、微小杆菌属(Exiguobacterium)、德库菌属(Desemzia)、库尔特氏杆菌属(Kurthia)。老面中主要的细菌是乳酸菌,乳酸菌能够形成细菌素和类细菌素等抑菌类物质,可以延长发酵面食的货架期,同时也能够产生胞外多糖(Exopolysaccharides,EPS)等增强免疫功能的物质[2,13-14]。然而在该样品中,属于乳酸菌的序列较少,因此可能存在一定的安全隐患,需要进一步研究证实。

在LM2样品中,共检测到5个门,优势门也是厚壁菌门,其序列所占比例高达99%。在科的水平上,乳杆菌科是主要的优势科,共有99%的序列属于乳杆菌科。在检测到的6个属中,丰度较高的为乳杆菌属(87%)。

通过比较上述分析结果,三个老面样品中细菌群落结构存在着一定的差异性,尤其是LM5样品,其优势菌群与另外两个样品存在着一定的差异。在LM17样品和LM2样品中丰度最高的属是乳杆菌属,它是LM5样品中的第二优势菌属,其比例仅有14%。LM5样品中丰度最高的葡萄球菌属未能在LM2中检测到,并且其在LM17样品中的比例也不足1%。除此之外,在LM5样品中丰度比较高的几个属,在LM17样品和LM2样品中的比例均较低甚至为零。不同老面样品中菌群出现差异的原因很多,主要是老面的制作环境比较开放,其次,原料品质、制作工艺、加工设备、制作环境等不同程度地影响着老面中的微生物多样性。

2.3系统发育分析

分别选自三个样品中序列数大于2%的OTU来构建细菌的系统发育树,如图4所示。在LM17样品中,丰度最高的两个OTU分别是LM17_2(22%)和LM17_1(17%),它们均与旧金山乳杆菌(L.sanfranciscensisstrainPON100118)(KM822615)和(L.sanfranciscensisstrain PON100419)(KM822616)呈现出较高的相似度,旧金山乳杆菌是制作发酵面团的主要菌种之一,属于专性异型发酵乳酸菌,具有蛋白酶、二肽酶和氨肽酶等的活性,同时在面团发酵过程中也能利用麦芽糖释放出葡萄糖,供一些不具备麦芽糖代谢功能的微生物(如假丝酵母,Candida humil)利用[15-17]。Minervini等[18]采用富集纯分离培养与鉴定的方法得出类似的结果,分离自19个老面样品的乳酸菌中,旧金山乳杆菌(占总乳酸菌比例的28%)是最主要的优势菌,其次是植物乳杆菌(占总乳酸菌比例的16%)。

在样品LM5中,丰度最高的OTU LM5_3(13%),以及丰度较低的OTU LM5_1和OTU LM5_6,均与马胃葡萄球菌(Staphylococcusequorumstrain bbm6)(KP224447)呈现出较高的相似度。有24条序列属于OTU LM5_5,占总序列的4%,以及丰度最低的OTU LM5_4,二者与松鼠葡萄球菌(Staphylococcussciuristrain 2218)(KR067567)和小牛葡萄球菌(Staphylococcusvitulinusstrain BCL-2)(KM378591)均显示出较高的相似度。Landeta等[19]对分离自腊肉中的微生物进行鉴定,其中马胃葡萄球菌是主要的优势菌,此外,葡萄球菌属能够释放脂酶并具有硝酸还原酶的活性,这在腊肉的风味和颜色方面发挥着重要的作用。

在样品LM2中,丰度最高的两个OTU LM2_1(54%)和LM2_5(12%),以及样品LM5中丰度第二高的OTU LM5_2(8%),也与上述两株菌呈现出较高的相似度。样品LM2中丰度相对较低的OTU LM2_3(3%),与乳杆菌(L.rossiaestrain PON100503)(KM822614)、植物乳杆菌(L.plantarumstrain THK-aB116)(JX566989)和(L.plantarumstrain Lu7)(KC478507)都显示出较高的相似度。植物乳杆菌是人体胃肠道的益生菌群,代谢过程中能够产生包括细菌素在内的多种天然抑菌物质,具有促进营养物质的吸收以及提高机体免疫力等多种功能。包含60条(3%)序列的OTU LM2_4,与面包乳杆菌(L.crustorumstrain M30I-9)(KJ361846)显示出较高的相似度。面包乳杆菌是一种新型益生菌,Sharafi等[20]从传统乳制品中也分离到了面包乳杆菌,其具有耐胆汁、耐酸、耐盐等特性,并且对肠道病原菌具有较强的抗菌活性。

3　结论

香格里拉县位于偏远的云南省迪庆自治州,当地发酵面食多选用自然发酵的老面作为发酵剂,老面样品中细菌群落结构除受气候因素的影响外,主要受自身制作环境的影响,因此采集自该地区的三个老面样品中细菌群落结构存在着一定的差异性。本研究中,样品LM5的多样性明显高于其他两个样品,其中的细菌结构及组成都比较复杂,同时还检出了较高比例的葡萄球菌属,葡萄球菌属中包含40个以上的菌种,其中一部分属于潜在的致病菌,除此之外,也不能排除葡萄球菌属外的其他潜在致病菌的存在,因此暗示了一些发酵面食可能存在着潜在的食品安全隐患。不同的是，有研究表明，在老面中检测到了一些其他条件致病菌，如粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、藤黄微球菌(M.luteus)、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)等[3,21-22〗[11-12]。

老面中,乳酸菌是重要的微生物组成部分,在样品LM17和LM2中,乳酸菌是主要的优势菌,乳酸菌能通过产生有机酸使原料快速酸化,此外,其产生的胞外多糖、细胞素、芳香物质等,也间接影响发酵面食的口感、质地、老化等品质,同时还有利于抑制发酵面食的微生物腐败。和单纯酵母发酵剂相比,老面制作的发酵面食口感和风味独特,可是后者更易出现食品安全隐患,因此,在以后的研究中,需要我们从老面样品中挖掘有益的微生物资源,摒弃其中的致病菌,调制出具有优良菌种组成(含乳酸菌)的发酵剂,从而制作出风味、品质俱佳的发酵面食。

[1]杨敬雨,刘长虹. 中国传统酵子的工业化[J]. 食品研究与开发杂志,2007,28(2):164-166.

[2]刘长虹,杨敬雨,韩俊俊,等. 传统酵子制作过程中微生物数量变化的研究[J]. 食品工业科技,2007,2007(2):76-78.

[3]杨浣漪,张国华,何国庆. 传统面食发酵剂中菌群多样性的研究[J]. 现代食品科技,2013,29(9):2115-2119.

[4]Hamady M,Walker J J,Harris J K,et al. Error-correcting barcoded primers for pyrosequencing hundreds of samples in multiplex[J]. Nature Methods,2008,5(3):235-237.

[5]Schmidt T M,DeLong E F,Pace N R. Analysis of a marine picoplankton community by 16S rRNA gene cloning and sequencing[J]. Journal of Bacteriology,1991,173(14):4371-4378.

[6]Thompson J R,Marcelino L A,Polz M F. Heteroduplexes in mixed-template amplifications:formation,consequence and elimination by ‘reconditioning PCR’[J]. Nucleic Acids Research,2002,30(9):2083-2088.

[7]Schloss P D,Westcott S L,Ryabin T,et al. Introducing mothur:Open-Source,Platform-Independent,Community-Supported Software for Describing and Comparing Microbial Communities[J]. Applied and environmental microbiology,2009,75(23):7537-7542.

[8]Thompson J,Gibson T,Plewniak F,et al. The CLUSTAL_X windows interface:flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools.[J]. Nucleic Acids Research,1997,25(24):4876-4882.

[9]Tamura K,Dudley J,Nei M,et al. Mega4:molecular evolutionary genetics analysis(Mega)software version 4.0[J].Mol Biol Evoi,2007,24(8):1596-1599.

[10]Saito N,and Nei M. The neighbor-joining method:a new method for reconstructing phylogenetic trees.[J]. Molecular Biology and Evolution,1987,4(6):406-425.

[11]Ercolini D,Pontonio E,Filippis F D,et al. Microbial Ecology Dynamics during Rye and Wheat Sourdough Preparation[J]. Applied and Environmental Microbiology,2013,79(24):7827-7836.

[12]Zhang G H,He G Q. Predominant Bacteria Diversity in Chinese Traditional Sourdough[J]. Journal of Food Science,2013,78(8):1218-1223.

[13]Vogelmanna S A,Hertel C. Impact of ecological factors on the stability of microbial associations in sourdough fermentation[J]. Food Microbiology,2011,28(3):583-589.

[14]苏东海,胡丽花,苏东民. 乳酸菌在传统主食馒头中的应用前景[J]. 中国农学通报,2010,2010(4):61-65.

[15]Gullo M,Romano A D,Pulvirenti A,et al. Candida humilis-dominant species in sourdoughs for the production of durum wheat bran flour bread[J]. In International Journal of Food Microbiology,2003,80(1):55-59.

[16]Gocmen D,Gurbuz O,Kumral A E,et al. The effects of wheat sourdough on glutenin patterns,dough rheology and bread properties[J]. Zeitschrift Fur Lebensmittel Untersuchung Und forschung A,2007,225(5-6):821-830.

[17]Vogelmann S A,Hertel C. Impact of ecological factors on the stability of microbial associations in sourdough fermentation[J]. In Food Microbiology,2011,28(3):583-589.

[18]Minervini F,Cagno R D,Lattanzi A,et al. Lactic acid bacterium and yeast microbiotas of 19 sourdoughs used for traditional/typical Italian breads:interaction between ingredients and microbial species diversity[J]. Applied and Environmental Microbiology,2012,78(3-4):1251-1264.

[19]Landeta G,Reveron I,Carrascosa A V,et al. Use of recA gene sequence analysis for the identification of Staphylococcus equorum strains predominant on dry-cured hams[J]. In Food Microbiology September,2011,28(6):1205-1210.

[20]Sharafi H,Derakhshan V,Paknejad M,et al. Lactobacillus crustorum KH:Novel Prospective Probiotic Strain Isolated from Iranian Traditional Dairy Products[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology,2015,175(4):2178-2194.

Pyrosequencing analysis of sourdough bacterial community diversity

ZHANG Hai-yan,LIU Chen-jian+,LIU Xiang-xiang,LUO Yi-yong,LI Xiao-ran*

(Faculty of Life Science and Technology,Kunming University of Science and Technology,Kunming 650500,China)

Sourdough has various microbial compositions, which brings various microbial fermentation products and flavors. Therefore,analysis of sourdough bacterial community diversity can provide useful information for developing better food fermentation agent. Three samples were collected from Shangri-La of Yunnan Province. After barcoded pyrosequencing,the microbial community diversity of the samples were analyzed. The three samples all had high bacterial diversity. In the 17-year-old and 2-year-old sourdough,the predominant bacteria wereLactobacillussanfranciscensis. The 2-year-old sourdough had small number of sequences belonging toL.rossiaeandL.plantarum. In 5-year-old sourdough,the predominant bacteria wasStaphylococcusequorum,followed byLactobacillussanfranciscensis. Conclusion:The samples of sourdough had higher bacterial community diversity dominated by lactic acid bacteria,andLactobacillusbringsa wealth of nutrients and flavor for fermentation pasta.Staphylococcusdetected of higher abundance implied potential risk in food safety.

Sourdough;bacterial community;pyrosequencing;diversity

2016-01-12+并列第一作者

张海燕(1987-),女,硕士生,研究方向:微生物分子生态学,E-mail:kgonghaiyan@163.com。

柳陈坚(1968-),男,博士,教授,研究方向:应用微生物,食品营养与安全,E-mail:newstaar8@hotmail.com。

李晓然(1984-),女,博士,副教授,研究方向:微生物分子生态学,E-mail:starkeyran@163.com。

国家自然科学基金项目(31260397)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)15-0145-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.15.020