韩国产炒紫苏子甲醇提取物的体外抗氧化及抗突变效果

宋家乐,顾廉洁，李雪梅,胡晓佳,周燕园,赵超超

(1.桂林医学院公共卫生学院，广西桂林 541004；2.广西高校预防医学重点实验室,广西桂林 541100;3.韩国国立釜山大学食品科学与营养学科,釜山 609-735)



韩国产炒紫苏子甲醇提取物的体外抗氧化及抗突变效果

宋家乐1,2,3,顾廉洁1，李雪梅3,胡晓佳3,周燕园1,赵超超1

(1.桂林医学院公共卫生学院，广西桂林 541004；2.广西高校预防医学重点实验室,广西桂林 541100;3.韩国国立釜山大学食品科学与营养学科,釜山 609-735)

目的:探讨三种韩国产炒紫苏子甲醇提取物(PSE)的体外抗氧化能力及抗突变能力。方法:以DPPH自由基、羟基自由基清除实验结合亚铁离子螯合实验,总还原力及亚油酸自氧化抑制实验评价三种PSE的体外抗氧化能力。鼠伤寒沙门氏菌突变回复Ames法评价体外抗突变能力。结果:三种PSE均具有较好的体外自由基清除能力和金属离子螯合能力,但其对DPPH自由基和羟基自由基的清除能力均弱于标准抗氧化剂叔丁基羟基茴香醚(BHA)。同时,三种PSE的总还原力和亚油酸自氧化抑制能力均强于BHA。此外,三种PSE中均含有较为丰富的多酚,黄酮和抗坏血酸;且对致突变剂N-甲基-N′-硝基-亚硝基胍(MNNG)诱发沙门氏菌TA100突变的抑制能力呈浓度依赖关系。结论:三种韩国产炒紫苏子具有的较强抗氧化能力和抗突变能力。三种韩国产紫苏子所具有的抗氧化能力和抗突变能力可能与其所含丰富的抗氧化物质有关。

炒紫苏子,提取物,抗氧化能力,抗突变活性

紫苏子是唇形科(Labiate)一年生草本植物紫苏(PerillafrutescensBritt var. japonica)的干燥成熟果实,因其富含亚麻酸、亚油酸等不饱和脂肪酸、氨基酸和蛋白质而日渐成为一种大众瞩目的保健食品原料[1-2]。紫苏子的加工,除传统的压榨制取紫苏子油外,高温炒制也是一种较常见的加工方式。有研究表明,炒紫苏子具有抗氧化[3-4]、抗过敏[5]、抗炎症[6-7]、提高免疫力[8]、降血脂[9]、抗应激[10]、抗血小板凝结[11]和提高小鼠智力[12]等生物学功能。而在同为亚洲国家的韩国,炒紫苏子也被当地人认为是一种药食同源保健品。目前,国内对炒紫苏子抗氧化的实验研究仅限于动物实验[3-4],对其体外抗氧化效果的研究相对较少。因此本实验旨在研究三种韩国产炒紫苏子提取物的体外抗氧化能力以及对鼠伤寒沙门氏TA100菌突变回复能力的影响效果。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

炒紫苏籽“Tayou”(批号:KDA-ML-2014-001)、“Guangyi”(批号:KDA-ML-2014-023)和“Duwu”(批号:KDA-ML-2014-041),由韩国农村经济合作发展厅国立食粮研究所提供。经低温冷冻干燥后保管于韩国国立釜山大学食品营养学科分子营养学研究室待用。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、三氯乙酸(TCA)、硫代巴比妥酸(TBA)、脱氧核糖、过氧化氢、Ferrozine试剂、抗坏血酸(Ascorbic acid)、没食子酸(Gallic acid,GAE)、芦丁(rutin)和BHA均购自美国Sigma公司。亚油酸、二甲亚砜(DMSO)、D-6-glucose-6-phosphate(NADP)、N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine,MNNG)和乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)购自日本关东化工有限责任公司。其他试剂均为分析纯购自韩国SAMCHUN纯药工业株式会社。

R-114旋转蒸发仪瑞士Buchi公司;MIR-254生化培养箱日本三洋电机株式会社;VS-15CFN冷冻离心机韩国Vision科学株式会社;UV-2401PC分光光度计日本岛津制作所株式会社;Bio-Rad 680酶标仪美国Bio-Rad公司。

1.2实验方法

1.2.1紫苏子甲醇提取物(PSE)的制备取冷冻干燥后的炒紫苏子10 g,研磨成细粉后按照料液比1∶20加入200 mL甲醇入锥形瓶中,28 ℃室温条件下连续搅拌24 h。收集样品甲醇提取液,50 ℃减压旋转蒸发制备得炒紫苏子甲醇提取物(PSE)。PSE以DMSO为溶剂配制成浓度为20 mg/mL的储备液,-20 ℃条件下保管待用[3]。“Tayou”、“Guangyi”和“Duwu”这三种炒紫苏子的甲醇提取物分别以PSET、PSEG和PSED表示。

1.2.2DPPH自由基清除实验96孔板中加入样品和DPPH(150 μmol/L)溶液各100 μL,混匀后,室温下避光反应30 min后,540 nm处测定吸光度OD值,按照公式:清除率(%)=[1-(OD样品-OD样品空白)/OD空白]×100计算。

1.2.3羟基自由基清除实验取200 μL的样品放入玻璃试管,并加入6 mmol/L的脱氧核糖,过氧化氢(3 mmol/L),PBS(pH7.4,20 mmol/L),氯化铁溶液(400 μmol/L),EDTA溶液(400 μmol/L)和抗坏血酸溶液(400 μmol/L)各200 μL。37 ℃水浴培养1 h。随后加入1% TBA和2.8% TCA溶液各1 mL,90 ℃水浴中培养30 min。加正丁醇提取色素并在3000 r/min条件下离心5 min,取上清于532 nm处测定吸光度OD值。按照公式:清除率(%)=(OD空白-OD样品)/OD空白×100计算。

1.2.4总还原力测定以PBS(pH6.6,20 mmol/L)配制1 mL样品液,加入浓度为10 mg/mL的铁氰化钾溶液1 mL,混匀后在50 ℃水浴中孵育20 min。再加入浓度为100 mg/mL的TCA溶液200 μL,在3000 r/min条件下离心10 min。取0.5 mL上清液加0.5 mL蒸馏水和1 mg/mL的氯化铁溶液0.1 mL后混合,在700 nm处读取OD值。吸光度越高说明样品的总还原力越强。

1.2.5亚铁离子螯合能力测定取不同浓度PSE提取物加入浓度为2 mmol/L氯化亚铁溶液50 μL,室温孵育后加入5 mmol/L的Ferrozine试剂200 μL,最后加入800 μL甲醇溶液。反应10 min后,在562 nm处读取吸光值。亚铁离子螯合能力=[1-(样品溶液的吸光度值/空白溶液的吸光度值)]×100%。

1.2.6亚油酸过氧化抑制能力测定在2.5 mL混合亚油酸乳剂(0.2 mol/L,pH7.0)体系中加入0.5 mL不同种类的PSE(样品浓度为200 μg/mL)和2.5 mL的PBS缓冲液(0.2 mol/L,pH7.0)。将反应混合物置于37 ℃黑暗条件下连续培养7 d。每天取样并依次加入5 mL的75%乙醇,0.1 mL浓度为20 mol/L的硫氰酸铵溶液(以3.5%盐酸配制),混匀后放置3 min。在500 nm处读取吸光度值。

1.2.7抗氧化物质总酚酸、总黄酮和抗坏血酸的测定将0.1 mL的PSE样品中加入10%的碳酸钠溶液2 mL反应5 min,再加入0.1 mL的福林酚试剂并置避光处反应30 min。750 nm测定吸光度值。总酚含量以GAE为标准计算并表示为mg GAE/g。比色法测定PSE中的总黄酮含量,取0.5 mL的PSE与2 mL蒸馏水混合,加入0.15 mL浓度为10%氯化铝溶液后在510 nm处测定吸光度值。总黄酮含量以芦丁为标准计算并表示为mg Rutin/g。PSE(50 mg)加入10 mL浓度为1%的偏磷酸溶液提取。在过滤滤液1 mL中加入2 mL 的9,6-二氯靛酚溶液,反应10 min后读取515 nm处吸光度值。总抗坏血酸含量以抗坏血酸(Ascorbic acid)为标准计算并表示为mg Ascorbic acid/g。

1.2.8抗突变能力测定选用引自美国加州大学Ames实验室,并经菌株特性鉴定实验且符合要求的鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型菌株TA100,采用平板渗入法,计算回变菌落数。每个样品分设50～200 μg/皿四个剂量组,每组5个平行皿,同时设自发回变和对照组。灭菌试管中加入PBS和含菌培养基(2×109cells/mL)各0.1 mL,不同浓度的PSE样品和致突变物MNNG各50 μL。充分混匀后,37 ℃下预培养30 min后加入2 mL顶层培养基。混匀平铺于事先制备好的底层培养基上。48 h培养后计算菌落数。以抗突变抑制率表示实验结果。

1.3数据分析

2　结果与分析

2.1三种PSE对DPPH自由基和羟基自由基·OH的清除能力

自由基是生物体组织内有氧呼吸过程中所产生的代谢副产物,过多自由基的堆积会导致组织发生氧化应急损伤,危及生物体健康;而合理使用抗氧化剂清除体内过多的自由基,有助于缓解氧化应激损伤[13]。如表1示,三种PSE提取物对DPPH自由基均具有良好的清除能力。其中PSED对DPPH自由基的半清除剂量IC50小于PSET和PSEG,但高于人工合成抗氧化剂BHA的IC50。同时,三种PSE也具有一定较好的对·OH自由基清除能力,结果与王钦富等结果较为一致[4]。PSET对·OH自由基的IC50小于PSEG和PSED,但高于BHA。总体而言,三种韩国产PSE对DPPH自由基和·OH自由基均具有一定的清除能力,但清除效果较人工合成抗氧化剂BHA稍弱。

表1　三种韩国产PSE对DPPH· 和·OH的半清除剂量IC50(μg/mL)Table 1　The IC50 of three kinds of roasted Korean perilla seed(PSE)to against DPPH and ·OH radicals(μg/mL)

注:同列不同字母表示各组数值与对照组相比差异显著(p<0.05)。

2.2三种PSE对亚铁离子螯合能力的影响

通过螯合亚铁离子等具有高度活性的金属离子则能抑制这些过量的金属离子导致的脂质过氧化,并减少其造成的脂质过氧化物的过量产生,从而间接反映出抗氧化剂的体外抗氧化能力[14]。如图1所示,三种韩国产PSE随着浓度的增高,其对亚铁离子的螯合能力也呈增强趋势。在最高浓度200 μg/mL处理时,PSED的亚铁离子螯合能力要稍强于PSET和PSEG。但三种韩国产PSE对亚铁离子的螯合能力均弱于EDTA-2Na对亚铁离子的螯合能力。

图1　三种韩国产PSE对亚铁离子螯合能力的影响Fig.1　Effect of three roasted Korean perilla seed (PSE)on ferrous ion chelating

2.3三种PSE对抑制亚油酸过氧化能力的影响

如图2示,在利用浓度为200 μg/mL的PSE干预不饱和脂肪酸亚油酸自氧化过程时,与对照组相比三种PSE均能有效降低亚油酸混合物在500 nm处的吸光度值,较低的A500 nm吸光度值则意味着反应体系中不饱和脂肪酸发生自氧化后所生成的氧化产物量的减少,从而提示样品抑制亚油酸自发过氧化的能力强。随着实验时间的延长,在实验的第7 d,PSED处理后的反应混合物在500 nm处的吸光度值(A500=0.217)低于PSEG(A500=0.242),与PSET(A500=0.226)接近,但远远低于对照组(A500=0.670),这些结果提示三种PSE都具有较强的亚油酸自氧化抑制能力,但其作用效果要弱于人工合成抗氧化剂BHA。

图2　韩国产PSE对亚油酸过氧化抑制能力的影响Fig.2　Effect of three roasted Korean perilla seed(PSE) on linoleic acid auto-oxidation inhibition activity

2.4三种PSE对总还原能力的影响

如图3所示,随着各PSE处理浓度的增加,其总还原能力也随之增强,并呈现出剂量效应关系。在最高浓度200 μg/mL处理时,三种韩国产PSE提取物的吸光度值均高于人工抗氧化剂BHA。结果提示三种PSE都具有较强的将亚铁离子(Fe2+)还原成铁离子(Fe3+)的供电子能力(即还原能力强)。而研究也发现,具有抗氧化活性的物质的总还原能力与其自身的抗氧化能力存在一定联系,即抗氧化剂的总还原能力越强则其抗氧化能力越高[15]。

图3　三种韩国产PSE对总还原能力的影响Fig.3　Effect of three roasted Korean perilla seed (PSE)on reducing power

2.5三种PSE中主要抗氧化活性成分含量

研究显示,植物提取物中多酚含量与其自身的抗氧化能力存在正关系,即含量越多则抗氧化能力越强[13]。而作为植物中次生代谢产物之一的多酚、黄酮类物质则具有清除自由基,抗脂质过氧化和提升体内抗氧化水平的功能作用;且保护心脑血管和抗癌、抗炎活性较强[14]。这些源自天然植物中的多酚黄酮类物质在具有强大抗氧化能力的同时,其毒性要远远小于人工合成抗氧化剂,被大量用作食品添加剂以维护人体健康[16]。如表2所示,三种韩国产PSE中均含有丰富的总酚酸、总黄酮和抗坏血酸等抗氧化活性成分。其中PSEG中总酚酸、总黄酮和抗坏血酸的含量较PSED和PSET中的含量要高。此结果与前述三种PSE的总还原力结果一致,提示提取物中的酚酸类、黄酮类以及抗坏血酸类物质对PSE的体外抗氧化能力提供主要贡献。

表3　三种韩国产PSE对在N-甲基-N′-硝基-亚硝基胍诱导下TA100 菌株的抗突变效果Table 3　Inhibitory activity of three roasted Korean perilla seed(PSE)against N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine induced mutations of Salmonella Typhimurium strain TA100

注:同列不同字母表示差异显著(p<0.05),与对照组字母标注不同表示与对照组差异显著(p<0.05),括号内的数据表示抑制率。

表2　三种韩国产PSE中总酚酸、总黄酮和抗坏血酸含量Table 2　Contents of polyphenols,flavonoids and ascorbic acid in three roasted Korean perilla seed(PSE)

2.6三种PSE抗突变效果影响

研究中,在直接致突变物MNNG(0.4 μg/皿)处理时,予以不同浓度的三种韩国产PSE提取物处理后发现,TA100菌自身的突变得到抑制,且突变抑制率随着处理浓度的增加而呈现一定的浓度剂量关系。在最高浓度200 μg/皿处理时,PSET对TA100菌的突变抑制率(40%)要高于PSED(33%)和PSEG(34%)。

3　结论

本研究发现,三种韩国产炒制紫苏子提取物PSE都具有较好体外抗氧化能力和抗突变能力。其中,三种PSE对DPPH自由基和羟基自由基的清除半抑制剂量IC50较BHA高。但其总还原能力和亚油酸自氧化抑制能力均高于人工抗氧化剂BHA。同时,三种PSE中天然抗氧化物质的含量也较为丰富。而通过抗突变实验,三种PSE对直接致突变剂MNNG所诱发的鼠沙门氏菌TA100也具有较强的抗突变能力,且效果呈剂量效应关系。综合上述对三种韩国产炒紫苏子甲醇提取物研究得出的结果提示,炒制紫苏子是一种具有较好抗氧化能力并具有较强抗突变能力的天然保健食品。三种韩国产炒紫苏子所具有的抗氧化能力和抗突变能力可能与其所含丰富的抗氧化物质有关。今后应对炒制紫苏子中具有抗氧化、抗突变活性的有效成分进行进一步分离分析,使其能用于新型保健食品的开发。同时也对中韩两国在炒制紫苏子的工艺流程方面的差异展开深入研究。

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Antioxidant activityinvitroand anti-mutation effect of methanol extract from roasted Korean perilla seed

SONG Jia-le1,2,3,GU Lian-jie1,LI Xue-mei3,HU Xiao-jia3,ZHOU Yan-yuan1,ZHAO Chao-chao1

(1.School of Public Health,Guilin Medical University,Guilin 541004,China；2.Guangxi Colleges and University Key Laboratory of Preventive Medicine,Guilin 541004,China;3. Department of Food Science and Nutrition,Pusan National University,Busan 609-735,South Korea)

Objective:To investigate the antioxidant activityinvitroand anti-mutation effect of methanol extract from three kinds of roasted Korean perilla seed(PSE). Methods:Antioxidant activities were determined by free radical(DPPH and hydroxyl radical)scavenging assay,metal-chelating assay,reducing power and linoleic acid emulsion assay. Anti-mutation activity of PSEs was determined by Ames assay. Results:Three kinds of PSEs showed a good free radical scavenging activity and metal-chelating ability. The DPPH and hydroxyl activities of PSEs were weaker than that in butyl hydroxy anisd(BHA). Meanwhile,the reducing power and linoleic acid auto-oxidation inhibition activity of PSEs were stronger than that in BHA. In addition,these PSEs also contained higher levels of antioxidant compounds(polyphenols,flavonoids and ascorbic acid),and also dose-dependently reduced the mutagenic MNNG induced mutation inSalmonellatyphimuriumstrain TA100. Conclusion:Three kinds of roasted Korean perilla seed exhibited the great antioxidant and anti-mutation activity,which were associated with their high levels of antioxidant compounds.

roasted perilla seed;extracts;antioxidant activity;anti-mutation activity

2015-12-16

宋家乐(1983-)，男，博士，副教授，研究方向：植物天然化学及分子营养学，E-mail:songjiale@glmc.edu.cn。

广西壮族自治区教育厅高校科学技术研究项目(LX2014257)；桂林医学院人才科研启动基金(04010150001)。

TS202.3

A

1002-0306(2016)15-0076-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.15.006