南极磷虾酶解液脱氟工艺的研究

郭　帆,施文正,汪之和

(上海海洋大学食品学院,上海 201306)



南极磷虾酶解液脱氟工艺的研究

郭帆,施文正*,汪之和

(上海海洋大学食品学院,上海 201306)

本文以脱氟率和氨基酸损失率为指标,比较了四种不同钙源物对南极磷虾酶解液氟脱除的影响。并结合吸附法与离子沉淀法共同脱氟,在单因素实验的基础上,以脱氟率为响应值,利用响应面优化法对结合脱氟方法进行优化。脱氟前后利用氨基酸自动分析仪检测酶解液中氨基酸种类与含量。结果表明,四种钙源物中乳酸钙对南极磷虾酶解液氟脱除效果最好。利用结合法脱氟的工艺条件为:乳酸钙与氧化铝质量比1∶4,酶解液pH9.0,流速2.0 mL/min,此时脱氟率可达到93.98%±0.04%。脱氟前后南极磷虾酶解液中氨基酸种类并没有发生变化,氨基酸总量损失率也仅为3.49%。由此证明,结合法对南极磷虾酶解液脱氟有良好的效果。

结合法,脱氟,响应面,氨基酸

南极磷虾是世界上数量最多的生物资源,其蕴藏量巨大,估计在6.5亿t到10亿t之间[1]。南极磷虾是可供人类利用的海洋动物资源中蕴藏量最为丰富的一种,也是人类重要的后备蛋白库[2]。南极磷虾营养丰富,除富含蛋白外,还含有人体所必需的全部氨基酸,富含亚油酸、亚麻酸等不饱和脂肪酸及钙、钾、镁、锶等多种矿物质元素[3]。且类胡萝卜素色素含量高。但南极磷虾有富集氟的特性,其氟含量极高。整虾干样中氟含量平均为1232 mg/kg;甲壳中氟的含量较高,平均为4028 mg/kg;肌肉中氟含量较少,平均为228 mg/kg[4]。南极磷虾各部位的氟含量远均远远高于我国对肉类和鱼类氟限量的要求2.0 mg/kg[5]。如此高的氟含量,使消费者担心食用南极磷虾会导致氟中毒,从而影响了对南极磷虾的食用。

南极磷虾酶解液有很大的开发潜力,酶解液中富含人类所需的所有必需氨基酸,但如同南极磷虾高的含氟量一样,其酶解液中的氟含量依旧很高。经检测,南极磷虾酶解液中氟含量约为50～80 mg/L。这远远高出国家对饮用水以及诸多食品的氟含量限量要求,为了使南极磷虾酶解液得到更好的利用,非常有必要对其进行降氟处理[6]。

目前我国除氟方法主要集中在水的脱氟处理。除氟技术方法主要有:吸附过滤法、离子沉淀法、电渗析法、反渗透、纳滤法等[7]。而南极磷虾脱氟的方法主要集中在钙离子沉淀法,活性氧化铝吸附法也仅用于含氟量较低的自来水脱氟。本文结合这两种氟脱除的方法,对南极磷虾酶解液中氟脱除做了研究,并达到了较高的脱氟率,为南极磷虾氟脱除提供了新的思路。

1　材料与方法

1.1材料与设备

实验所用南极磷虾捕捞于南极海域FAO48.2区,捕捞后于-20 ℃条件下保存。

木瓜蛋白酶(酶活≥6000 U/mg)、氟化钠、三水合乙酸钠、二水合柠檬酸钠、高氯酸、冰醋酸、浓盐酸、硫酸铜、硫酸钾、甲醛、氢氧化钠、无水氯化钙、氧化钙、一水合醋酸钙、五水合乳酸钙等分析纯,国药集团化学试剂有限公司;实验所用水去离子水。

JYL-C020型组织搅碎机九阳料理机;BSA型分析天平梅特勒-托利多仪器有限公司;PHS-3C型精密酸度计上海雷磁仪器厂;JB-1A型磁力搅拌器上海精密科学仪器有限公司;PF-1型氟离子选择电极上海雷磁精密仪器有限公司;232单盐桥型甘汞参比电极上海雷磁精密仪器有限公司;CR-21G型高速冷冻离心机日本HITACHI公司;L-8900氨基酸自动分析仪日本HITACHI公司。

1.2测定方法

1.2.1氟含量的测定方法按GB/T5009.18-2003食品中氟的测定中氟离子选择电极法测定[8]。

降氟率(%)=(1-降氟前酶解液中氟含量(mg/L)/降氟后酶解液中氟含量(mg/L))×100

1.2.2氨基酸含量测定按GB/T5009.124-2003食品中氨基酸的测定方法测定[9]。

氨基酸损失率(%)=(1-降氟前酶解液中氨基酸含量(mg/L)/降氟后酶解液中氨基酸含量(mg/L))×100

1.3实验方法

1.3.1酶解液的制备冻藏的南极磷虾在自然条件下解冻。组织搅碎机搅成浆状后1∶2比例加水,加0.3%木瓜蛋白酶,调节pH到7.5,50 ℃下酶解5 h,冷却,13000 r/min、4 ℃下离心30 min[10],所得上清液即为实验用酶解液。

1.3.2不同钙源物对南极磷虾酶解液氟脱除的影响无机钙源选择生石灰(CaO)、氯化钙(CaCl2),有机钙源选择乳酸钙[Ca(CH3CHOHCOO)2·5H2O]、醋酸钙[Ca(CH3COO)2·H2O]。每种钙源物的添加量如表1所示。取10 mL南极磷虾酶解液于烧杯中,分别添加不同量的钙源物,调节pH到9,用恒温加热搅拌器搅拌至固体全部溶解[11],结果用SPSS软件进行分析。

表1　不同钙源物的添加量Table 1　Addition of different calcium sources

1.3.3吸附法结合Ca2+沉淀法脱氟的单因素实验以4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4的质量比将脱氟效果最好的钙源物与活性氧化铝混合,填充于内径为2.5 cm的交换柱中,装柱高约为整柱高的一半。制备好的南极磷虾酶解液分成7份,分别调pH到5、6、7、8、9、10、11。再分别以0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5 mL/min的速度通过每种比例的交换柱,收集到的滤液通过0.45 μm的微滤膜后测定其氟含量,氨基酸含量。考虑到南极磷虾酶解液通过交换柱时,反应温度难以保持在恒定温度不变。本实验参考李红艳[7]、吕传萍[13]等的相关研究,选取室温(25 ℃)为本实验反应的环境温度。

1.3.4响应面法优化脱氟工艺在单因素实验的基础上,以两种物料比例、pH、流速为参考因素,以脱氟率为响应值,应用Design-Expert 8.0.6软件进行数据分析并建立数学回归模型,确定脱氟的最佳工艺。共有17个实验。因素设计表如表2所示。

表2　响应面因素设计表Table 2　Factors design of response surface

2　结果与分析

2.1不同钙源物对南极磷虾酶解液氟脱除的影响

李红艳[7]对纳滤法、电渗析法、钙离子沉淀法三种方法脱除南极磷虾酶解液中氟的含量进行过比较。结果表明钙离子沉淀法操作简单,且脱氟效果明显,是一种很好的酶解液脱氟方法。钙离子沉淀法的原理是钙离子与氟离子结合形成氟化钙沉淀,通过微滤法除去反应后溶液中的沉淀物。本文研究针对南极磷虾酶解液,比较了不同钙源物对其氟脱除的效果。选取两种无机钙源(生石灰和氯化钙)和两种有机钙源(醋酸钙和乳酸钙)进行实验。如图1、图2可知,氟含量和氨基酸含量均随着钙源物添加量的增加而减少,当四种钙源物添加量≥125 mmol/L时,四种钙源物对氟含量降低的影响均不再显著(p>0.05),当四种钙源物添加量≥145 mmol/L时,四种钙源物对氨基酸含量的影响不再显著(p>0.05)。这与王灵昭[14]的研究结果基本吻合。当钙源物添加量相同时,添加有机钙源的酶解液中氟含量明显低于添加无机钙源酶解液中氟含量,而氨基酸含量也明显高于无机钙源。这就表明有机钙源降低氟含量的效果优于无机钙源。由图可以明显看出,四种钙源物中,乳酸钙对样品氟脱除效果最优,对酶解液营养影响最小。这可能是由于乳酸钙易溶于水,而且其为人体补充钙的良好钙制剂,使其在南极磷虾酶解液中更容易吸收,从而达到良好的降氟效果。

图1　不同钙源物对南极磷虾酶解液氟含量的影响Fig.1　Effects of different calcium source solution of fluorine content on Antarctic krill hydrolysate注:不同字母表示组间显著性差异(p<0.05),图2同。

图2　不同钙源物对南极磷虾酶解液氨基酸含量的影响Fig.2　Effects of different calcium source solution of amino acid on Antarctic krill hydrolysate

2.2吸附法结合Ca2+沉淀法脱氟的单因素实验

2.2.1质量比对降氟率的影响随着m乳酸钙:m氧化铝的减小,酶解液脱氟率明显增加,当m乳酸钙∶m氧化铝达到1∶4后,脱氟率达到94.25%,此时交换柱流出酶解液中氟含量仅为1.94 mg/L,已经达到国家饮用水规定氟含量的安全标准。在总质量不变的情况下,随着乳酸钙含量的增大,脱氟率减小,这可能是由于酶解液流过交换柱时,与交换柱中填充的乳酸钙反应生成大量结晶氟化钙,阻碍了活性氧化铝吸附酶解液中氟的缘故。实验结果与Islam M[12]等的研究结果类似。Islam M的相关研究表明,随着钙源物添加量增大,反应活性位点重叠,导致反应有小面积减少使得脱氟率有所降低。如图3所示,当m乳酸钙∶m氧化铝≈1∶4时,此时酶解液脱氟率不再有明显的变化,故取1∶5～1∶3为响应因素范围值。

图3　质量比对降氟率的影响Fig.3　Effect of mass ratio on reducing fluoride

2.2.2pH对降氟率的影响由图4可知,随着酶解液pH的升高,降氟率呈现先快速上升后基本稳定不变的趋势。当pH呈碱性时,降氟率明显升高。当pH>10时,降氟率稍有降低的趋势。这与李红艳、吕传萍等的研究略有不同。李红艳[7]的研究表明,pH>10时脱氟率不再明显变化可能是因为酶解液中大量氨基酸小肽起到了缓冲作用。吕传萍[13]认为当pH>10时,反应到达平衡状态,降氟率不再升高。由本实验结果看,pH>10时降氟率略有降低。这可能是实验原因所造成的误差。也可能是溶液呈碱性时,Ca2+与OH-容易结合形成Ca(OH)2使活性氧化铝表面堵塞,从而导致酶解液不能与吸附剂充分反应,造成降氟率有所降低。故实验选取pH8～10为最佳响应面取值范围。

图4　pH对降氟率的影响Fig.4　Effect of pH on reducing fluoride

2.2.3流速对降氟率的影响由图5可以看出,降氟率随着通过交换柱酶解液流速的升高呈现先增大后减小的趋势。这可能是因为流速过小时,酶解液中氟与交换柱填充料充分反应形成的不溶物阻碍反应继续发生。而当流速过快时,部分酶解液未与混合脱氟物料反应。当流速为2.0 mL/min时,酶解液中氟的脱除率达到最大93.26%，故实验选取1.5～2.5 mL/min为响应面实验范围。

图5　流速对降氟率的影响Fig.5　Effect of flow rate on reducing fluoride

2.3响应面优化实验

响应面设计方案及响应结果如表3所示。

2.3.1方差分析方差分析结果见表4。

利用软件对实验结果进行回归拟合,得到的回归方程为:Y=+85.45+4.28A+1.97B+1.90C-1.34AB-1.09AC-1.17BC-1.68A2-1.21B2-3.64C2。由表4可知,失拟项的p值>0.05,而模型的p值<0.0001,表明模型高度显著,该模型拟合程度良好,实验误差小,可以对吸附法结合Ca2+沉淀法脱氟影响进行分析和预测。

表3　Box-Bohnken设计方案及响应结果值Table 3　Box-Bohnken design scheme and response results

表4　因素的方差分析Table 4　Analysis of variance

注:p≤0.01 为极显著,用**表示;p≤0.05 为显著,用*表示;p>0.05 为不显著。

2.3.2响应面图优化手动优化后,所做的响应面图如图6～图8所示。

图6　质量比和pH对降氟率的影响Fig.6　Effects of mass ratio and pH on reducing fluoride

图7　质量比和流速对降氟率的影响Fig.7　Effects of mass ratio and flow rate on reducing fluoride

图8　pH和流速对降氟率的影响Fig.8　Effects of pH and ratio on reducing fluoride

由图6、图7、图8可以看出,在所选范围之内,脱氟率随乳酸钙与氧化铝质量比的加大而减小,随pH的升高先增加后略微降低,随流速的增大先增大后减小。并且相互之间交互作用显著,三个因素中乳酸钙与活性氧化铝质量比对降氟率的影响最明显,这与表4的结果一致。

2.3.3验证实验通过Design-Expert 8.0.6软件对经手动优化后的回归方程求解[11]。在实验的因素水平范围内预测的吸附法结合Ca2+沉淀法脱氟最佳条件为:乳酸钙与活性氧化铝质量比1∶4.38,pH8.97,流速2.07 mL/min。在此条件下酶解液脱氟率达到94.14%。结合实际条件将其修正为质量比为1∶4,pH9.0,流速2 mL/min。在此条件下,进行了验证实验,测得的脱氟率为93.98%±0.04%,与理论预测脱氟率基本吻合,说明手动优化后的分析和预测都非常可靠。与氯化钙法脱氟、生石灰法脱氟的脱氟率比较,结合法对南极磷虾酶解液的脱氟效果明显优于单一钙源法。

2.3.4酶解液中氨基酸含量的变化考虑到在脱氟的过程中酶解液中营养物质可能会受到影响,故以酶解液中氨基酸含量为指标来检测反应前后其营养的变化。南极磷虾富含人体所需的所有必需氨基酸,经检测其酶解液中共有18种氨基酸,其中谷氨酸含量最高[15]。数据如表5,脱氟前后氨基酸损失率仅为3.49%。证明了活性氧化铝吸附法结合乳酸钙沉淀法脱氟对酶解液中营养物质氨基酸的含量影响并不明显。

3　结论

钙离子沉淀法是常用的脱氟方法,本文比较了有机钙源和无机钙源对南极磷虾酶解液的脱氟效果,结果表明在所选用的四种钙源物中,乳酸钙的降氟效果最优。

表5　脱氟前后酶解液中氨基酸含量变化Table 5　Changes of amino acid content before and after reaction

本文结合活性氧化铝吸附脱氟法和钙离子沉淀脱氟法,通过氧化铝与乳酸钙以不同比例混合后填充交换柱,不同pH的南极磷虾酶解液以不同流速经过交换柱进行脱氟,在做了单因素实验基础上进行响应面优化,确定了结合脱氟法的较优工艺:乳酸钙与活性氧化铝的质量比1∶4,pH9.0,流速2.0 mL/min,此条件下脱氟率可达到93.98%。

对南极磷虾酶解液脱氟前后的氨基酸含量进行

检测,结果表明结合脱氟法对南极磷虾酶解液中氨基酸含量影响较小,脱氟前后总氨基酸损失率仅为3.49%。

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Study on fluoride removal of Antarctic krill hydrolysate

GUO Fan,SHI Wen-zheng*,WANG Zhi-he

(College of Food Sciences,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China)

In this study,the rate of defluorinating and amino acid losses removal rate were regarded as the index.The effects of four different calcium sources to Antarctic krill hydrolysate fluoride removal were compared.Adsorption and ion precipitation were combined to remove the fluoride.Based on the single factor experiment,the rate of defluorinating being as the response value,and the study used the response surface optimization method to optimize defluorinating method.The kinds and contents of amino acids in the peptide was detected by automatic amino acid analyzer before and after experiment.The results showed that,calcium lactate was the best calcium sources of removing fluoride.The best removal technological conditions were as follows:mass rate was 1∶4,pH was 9.0 and the flow rate was 2.0 mL/min.The removal fluoride reached 93.98%±0.04% under this condition.The kinds of amino acids in the peptide were not changed before and after the removal of fluorine,the total loss rate of the amino acids was only 3.49%.The results indicated that the combined methods had good effect on enzymatic hydrolysate defluorination.

combined method;fluoride removal rate;response surface;amino acid

2015-11-19

郭帆(1991-)，女，硕士在读，研究方向：水产品加工与利用，E-mail：424336379@qq.com。

施文正(1975-)，男，博士，副教授，研究方向：水产品加工与食品风味，E-mail：wzshi@shou.edu.cn。

南极海洋生物资源开发利用项目(2015)；国家“863”高新技术研究发展计划( 2011AA090801)； 上海高校一流学科建设项目资助。

TS201.1

B

1002-0306(2016)09-0245-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.09.039