吸烟对类风湿关节炎外周血芳香烃受体的影响

程 琳，钱 龙，李向培，厉小梅，汪国生



吸烟对类风湿关节炎外周血芳香烃受体的影响

程 琳1，钱 龙2，李向培1，厉小梅1，汪国生1

目的 检测吸烟类风湿关节炎（RA）患者和健康者外周血单个核细胞（PBMCs）中芳香烃受体（AHR）、芳香烃受体抑制因子（AHRR）、细胞色素P4501A1（CYP1A1）的表达水平，探讨吸烟影响RA发生、发展的可能原因。方法 采用荧光定量PCR检测58例RA患者和30例健康者PBMCs 中AHR、AHRR、CYP1A1 mRNA的相对表达量，分析吸烟对3者表达的影响。结果 RA吸烟组AHR、AHRR、CYP1A1 mRNA的表达明显高于非吸烟组（P＜0.05），而健康者吸烟组与非吸烟组AHR、AHRR、CYP1A1 mRNA的表达差异无统计学意义；RA吸烟者AHR mRNA的表达明显高于健康吸烟者（P＜0.05），而RA非吸烟者与健康非吸烟者之间差异无统计学意义。结论 RA中可能存在某种途径使AHR易被烟草化合物活化，进而致AHR、AHRR、CYP1A1 mRNA高表达，使香烟成为RA的危险因素。

关节炎，类风湿；吸烟；芳香烃受体抑制因子；细胞色素P450

网络出版时间：2016-6-6 13：52：32 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160606.1352.038.html

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以对称性多发性关节炎为主要表现的自身免疫性疾病，其发病率约1%［1］。研究［2］表明RA患者持续吸烟会导致更高的疾病活动性和更严重的致残性，而烟草中许多化合物是芳香烃受体（Aryl hydrocarbon receptor，AHR）高亲和力配体，可能参与AHR活化的信号途径。AHR在配体如二噁英（2，3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin，TCDD）存在下，可影响细胞的发育分化，AHR功能的缺陷或者亢进都可导致免疫功能紊乱［3-4］。细胞色素 P4501A1（cytochromeP4501A1，CYPlAl）是酶细胞色素P450家族成员，是目前研究最多的应答基因，AHRR是 AHR抑制因子，是一种负反馈转录因子。AHR被香烟中化学物如TCDD激活后，二者表达明显升高［2，5-6］。该实验通过检测单个核细胞（PBMCs）中AHR、AHRR及CYP1A1 mRNA的表达，分析吸烟对3者的影响，探讨吸烟影响RA发生发展的可能原因，为临床治疗RA提供线索。

1　材料与方法

1.1病例资料 RA吸烟组：男14例，女15例，年龄29～72（50.9±1.0）岁，病程0.5～30年；RA非吸烟组：男15例，女14例，年龄29～69（47.5± 7.7）岁，病程0.25～38年，均为2014年4月～2014 年12月于安徽医科大学附属省立医院门诊和住院部就诊的未使用过来氟米特的患者，且当前仅使用甲氨蝶呤，两组间差异无统计学意义。RA诊断符合美国风湿病学会（ACR）1987年分类诊断标准。健康者吸烟组：男8例，女 7例，年龄 29～70（48.8 ±0.9）岁；健康者非吸烟组：男8例，女7例，年龄28～71（47.2±1.3）岁，健康者来源于我院同期体检中心。RA组与健康组中吸烟者均持续长期吸烟［2］，且为主动吸烟。为排除体内炎症因子过高可能对实验结果造成影响，患者无关节肿痛，血沉（erythrocyte sedimentation rata，ESR）、C-反应蛋白（C-reactive protein，CRP）均为正常水平且DAS28＜3.2。

1.2荧光定量PCR（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）技术检测 采集符合两组标准的静脉血5 ml于抗凝管中，用Ficoll-Hypaque密度梯度分离法加淋巴细胞分离液分离PBMCs。分离出的PBMCs加1 ml TRIzol吹打混匀提取总RNA，反转录获得cDNA。以cDNA为模板，SYBR Green RT-PCR检测外周血中AHR、AHRR、CYP1A1 mRNA的表达。其中按试剂盒内说明书建立PCR反应体系，总体积为20 μl。反应条件：95℃30 s，95℃ 5 s，60℃ 34 s，循环40次。引物设计及合成：在NCBI数据库中查找人AHR、AHRR、CYP1A1基因整个序列，以β-actin作为内参基因。以Primer Ex.press 2.0软件设计扩增模板的引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成，见表1。数据通过使β-actin参照基因作标准化处理得到ΔCt（ΔCt=待测基因Ct-β-actin Ct），病例样本基因相对于对照样本基因的量常用2-ΔΔCt计算获得。（ΔΔCt=ΔCt病例-ΔCt对照）。

基于以上的学习模式，英语零班适用于英语基础较好，对英语具有浓厚的学习兴趣及热情，并具备很强的学习主动性，能够积极主动的完成学习任务，并具备团队意识，协作能力强的学生。

表1　引物序列

1.4RA活动性评分 采用DAS28［7］评分RA疾病活动，以28个关节计分，包括双肩、双肘、双腕、双手掌指关节、双手近端指间关节、双膝关节。

1.3其他临床指标检测 魏氏法测ESR，免疫散射比浊法测CRP，ELISA检测抗CCP抗体，试剂购自欧蒙（德国）医学实验诊断有限公司，严格按试剂盒说明书进行操作。

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1.5统计学处理 采用SPSS 19.0统计学软件进行分析，计量资料正态分布以±s表示，非正态分布以中位数（下四分位数，上四分位数）表示；两组间符合正态分布和方差齐性采用t检验，不符合正态采用秩和检验；变量间符合正态分布用Pearson相关分析，变量间非正态分布用Spearman相关分析。

2　结果

“刘先生吗？”车里一个人问。刘雁衡低头一看，是司机老黄，便点点头。老黄朝后座那人说了句什么。车门随即打开，一个高大的军人走下来。

RA是一种慢性自身性免疫疾病，主要以破坏性多发性关节炎为主要表现，同时还可有许多关节外表现，其确切的病因和发病机制仍不清楚，一般认为主要是多种环境因素和遗传因素共同作用的结果。在环境因素中烟草中多种化合物如卤代芳香烃类、TCDD、多环芳香烃类苯并二奈、BAP、3-MC是AHR的强激动剂，通过结合AHR进而激活其经典信号通路或旁路途径，调节 T细胞、B细胞、DC细胞、巨噬细胞等细胞的分化及炎性细胞因子的分泌，导致免疫疾病的产生包括RA［8］。O′Donnell et al［9］在斑马鱼活体内实验，表明LEF原型可抑制斑马鱼鱼鳍再生的作用；同时用LEF处理WT Hep1c1c7细胞，其应答基因CYPlAl表达明显上调，表明LEF是AHR配体且对AHR及其应答基因有影响。因此，本实验为排除LEF对 AHR影响，选用的吸烟和非吸烟RA患者均未使用过LEF。

图1　AHR mRNA相对表达量的比较

图2　AHRR相对表达量的比较

2.5AHRR mRNA与CYP1A1 mRNA表达的相关性 RA患者AHRR mRNA与CYP1A1 mRNA的表达呈正相关（P=0.013，rs=0.363）。

图3　CYP1A1相对表达量的比较

Xk的估计值为以及当前状态对应的误差相关矩阵为Rk|k。卡尔曼滤波分为2个阶段：预测和测量更新。首先，KF根据上一时刻系统状态的估计值对当前状态做出预测：

2.4AHR mRNA表达量在组间的比较 RA患者外周血AHR mRNA的表达［1.55（0.82，2.46）］明显高于健康者［0.73（0.18，1.91）］，差异有统计学意义（P=0.005，Z=-2.780）；RA吸烟者 AHR mRNA的表达［2.23（1.19，3.33）］高于健康吸烟者［0.24（0.080，3.13）］，差异有统计学意义（P= 0.014，Z=-2.450）；而RA非吸烟者［1.03（0.54，2.00）］与健康非吸烟者［1.12（0.67，1.91）］差异无统计学意义（P=0.939，Z=-0.076）。见图4。

2.3CYP1A1 mRNA相对表达水平 RA吸烟组CYP1A1 mRNA表达水平［1.12（0.61，2.87）］高于RA非吸烟组［0.75（0.28，1.48）］，差异有统计学意义（P=0.027，Z=-2.207）；健康者吸烟组CYP1A1 mRNA水平［0.10（0.01，0.42）］与健康者非吸烟组［0.21（0.09，0.28）］比较，差异无统计学意义（P=0.379，Z=-0.923）。见图3。

2.6关于临床数据研究 吸烟RA患者AHR mRNA、AHRR mRNA与CYP1A1 mRNA的表达与其临床相关参数均无相关性，见表2。

2.1AHR mRNA相对表达水平 RA吸烟组AHR mRNA水平［2.16（1.15，3.22）］显著高于 RA非吸烟组［1.02（0.56，1.91）］，差异有统计学意义（P= 0.003，Z=-3.747）；健康者吸烟组AHR mRNA表达水平［1.922（0.245，4.460）］与健康者非吸烟组［1.118（0.671，1.912）］差异无统计学意义（P= 0.254，Z=-1.141）。见图1。

图4　AHR mRNA相对表达量

表2　RA吸烟者外周血AHR mRNA、AHRR mRNA和CYP1A1 mRNA相对表达和其临床指标相关性

3　讨论

2.2AHRR mRNA相对表达水平 RA吸烟组AHRR mRNA表达水平［1.684（0.808，3.595）］明显高于RA非吸烟组［0.87（0.46，1.93）］，差异有统计学意义（P=0.032，Z=-2.139）；健康者吸烟组AHRR mRNA水平［0.24（0.15，4.46）］与健康者非吸烟组［1.12（0.67，1.91）］比较，差异无统计学意义（P=0.899，Z=-0.154）。见图2。

AHR的活化主要为经典途径，即在没有配体条件下，AHR与伴侣蛋白在胞质中保持无活性。在配体如香烟中化学物TCDD等存在时，AHR与伴侣蛋白解离，与TCDD形成复合物，易位到细胞核，形成复合物结合到细胞核启动子区外源反应元件特殊DNA序列，调节下游基因如 CYP1A1、AHRR的表达［10］。AHR也可在配体存在下，通过诱导调节性T细胞的表达，激活转录因子NF-κB，或者通过抑制产生IL-17的Th17细胞进而调控免疫系统疾病如RA［11-12］。AHR可能在配体作用下活化，激活下游基因，进而产生炎症反应和免疫疾病发生，也可在配体下抑制炎症产生，表明AHR有两面性。本实验主要探讨烟草中化合物作用于AHR产生免疫疾病如RA的过程的有关研究。

流行病学证明吸烟是RA的重要危险因素，同时证明RA患者持续吸烟会导致更严重的疾病过程。Tamaki et al［13］用3-MC处理来自RA患者的成纤维细胞样滑膜细胞系MH7A，检测到AHR应答基因CYPlAl mRNA明显升高，同时在RA中起重要作用的促炎细胞因子IL-1β mRNA也明显高表达，且该过程可被AHR拮抗剂萘黄酮所阻断，TCDD、BAP处理MH7A系也得到与3-MC同样结果，表明烟草中多种化合物可激活AHR，进而上调促炎细胞因子的表达，导致RA的发展。Brauze et al［14］用TCDD处理大鼠，处理组中鼠肝脏中AHR、AHRR及CYP1A1的mRNA的表达水平明显高于对照组。Kazantseva et al［2］提取吸烟和非吸烟RA患者滑膜，结果得出吸烟RA患者滑膜中AHRR和CYP1A1明显高于非吸烟者，表明香烟中许多化合物可能作用于AHR，使其活化，进而致AHRR和CYP1A1高表达。基于以上研究，推断香烟中的多种化合物可能通过活化AHR，使应答基因CYP1A1和AHRR高表达，启动一系列信号通路，使各种促进因子的表达上调，进而促进RA的发生发展，成为其危险因素。

目前探讨吸烟为RA危险因素的可能原因的研究也越来越多，但尚缺乏外周血中相关研究。本实验首次通过检测RA吸烟患者与RA非吸烟患者外周血AHR及其应答基因AHRR和CYP1A1 mRNA的表达，通过分析比较结果，推测吸烟影响RA发生、发展的可能原因。本研究表明RA吸烟患者外周血AHR、AHRR、CYP1A1的mRNA表达显著高于非吸烟患者，与研究［8，13-14］一致，提示吸烟可能通过上调AHR使其活化，其应答基因如AHRR和CYP1A1 mRNA高表达，进一步激活炎性信号通路，参与RA的发病机制，使得吸烟成为 RA的危险因素。本实验表明RA患者外周血AHR mRNA的表达显著高于健康者，与研究［15］一致，同时得出RA吸烟者AHR mRNA的表达明显高于健康吸烟者，而RA非吸烟者与健康非吸烟者之间差异无统计学意义，进一步说明香烟可能使RA外周血中AHR高表达。CYP1A1与AHRR呈明显正相关性，与Kazantseva et al［2］在RA滑膜组织研究一致。RA吸烟者外周血AHR、CYP1A1、AHRR的mRNA表达与患者RF、抗CCP、疾病病程及吸烟量无相关性，可能因为影响临床资料因素如感染、肥胖、基因遗传多态性及样本量大小等较多。

（3）保安全，增强水运保障能力。坚决守住安全这条底线红线。加快实施渡改桥工程，全面取消一、二类江河渡口和车渡，逐步取消其他渡口。提高安全标准，积极推进库区渡口渡船标准化建设。强化安全风险防控和隐患治理，加快安全监测巡航救助一体化建设，提升应急救援能力。全面履行监管职责，构建以“行业监管责任、政府属地责任、企业主体责任”为支撑的安全责任链。

综上所述，RA中可能存在某种途径使外周血PBMCs中AHR易被活化，导致AHR及其下游基因CYP1A1和AHRR mRNA高表达，进而激活炎性信号途径，参与RA的发病机制，成为RA的危险因素，而AHR可能为临床治疗RA提供更多途径。

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Effect of smoking on peripheral blood aryl hydrocarbon receptor of rheumatoid arthritis

Cheng Lin1，Qian Long2，Li Xiangpei1，et al
（1Dept of Rheumatology and Immunology，Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230001；2Dept of Rheumatology and Immunology，Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230601）

Objective To explore the possible reasons of the influence about smoking on rheumatoid arthritis（RA）through detecting the mRNA levels of aryl hydrocarbon receptor（AHR），its response gene cytochrome P4501Al （CYPlA1）and the repressor AHRR in peripheral blood mononuclear cells（PBMCs）of both patients and healthy controls.Methods Real-time PCR was used to assess the expression of peripheral blood AHR，AHRR，CYP1A1 from 58 patients with RA and 30 healthy subjects，then effects of smoking on the expression of AHR，AHRR and CYP1A1 were analyzed.Results The expressions of AHR，AHRR and CYP1A1 at mRNA level were significantly higher in patients who were smoking than those who were non-smokers（P＜0.05）.However，there were no statistically significant differences between smoking healthy subjects and nonsmoking controls.Furthermore，we concluded that the expression of AHR was obviously increased in smoking RA patients than that in smoking healthy controls（P ＜0.05），and no significant differences were found between nonsmoking patients and nonsmoking healthy subjects. Conclusion Smoking is involved in the pathogenesis of RA and then becomes a risk factor which may influence the expression of AHR，AHRR，CYP1A1 in PBMCs from patients with RA.

arthritis，rheumatoid；smoking；aryl hydrocarbon receptor repressor；cytochrome P4501A1

R 593.22

A

1000-1492（2016）07-1006-05

2016-03-23接收

中华医学会临床医学科研专项资金-风湿病学发展与研究资金项目（编号：12040800380）

1安徽医科大学附属省立医院风湿免疫科，合肥 2300012安徽医科大学第二附属医院风湿免疫科，合肥 230601

程 琳，女，硕士研究生；钱 龙，男，教授，硕士生 导师，责任作者，E-mail：clahu2013@126.com