反相HPLC法同时测定大麻植物中的三种有效成分

傅　强，舒　智，邓　轲，罗　璇，曾昌广（.德阳市公安局刑警支队，四川 德阳 68000；.临沧市公安局，云南 临沧 677000）

反相HPLC法同时测定大麻植物中的三种有效成分

傅强1，舒智2，邓轲1，罗璇1，曾昌广1
（1.德阳市公安局刑警支队，四川 德阳 618000；2.临沧市公安局，云南 临沧 677000）

目的 建立同时测定大麻植物中四氢大麻酚（tetrahydrocannabinol，THC）、大麻二酚（cannabidiol，CBD）和大麻酚（cannabinol，CBN）三种有效成分的高效液相色谱（HPLC）法。 方法 采用通用C18色谱柱，以乙腈-磷酸盐缓冲液（0.015mol/L KH2PO4）为流动相，流速为1.0mL/min，检测波长为220nm，同时收集波长190～400nm的紫外光谱图，并以此光谱图及保留时间作为定性依据。结果 所建方法能良好地分离THC、CBD和CBN，三种成分在0.4～40μg/mL范围内线性关系良好（R2≥0.9993），回收率大于87%，最低检出限分别为1.8、2.0和1.3ng，日内精密度与日间精密度均小于5%。结论 反相HPLC法简便、快速、准确，适用于大麻植物中THC、CBD和CBN的定性定量检测。

法医毒理学；高效液相色谱；大麻属；四氢大麻酚；大麻二酚；大麻酚

大麻植物（Cannabis sativa L.）中所含化学成分十分复杂，现在能从大麻植物中提炼和鉴别出的化合物已经有400多种，其中最主要的活性成分是四氢大麻酚（tetrahydrocannabinol，THC）、大麻二酚（cannabidiol，CBD）和大麻酚（cannabinol，CBN）。其中，THC具有强烈的致幻作用，是造成大麻具有精神活性的“元凶”。根据其THC含量的高低，大麻植物可分为毒品大麻和工业大麻两类［1］。毒品大麻因THC含量高，被一部分人当毒品利用，大麻与海洛因、可卡因被称为全球三大传统毒品。2003年1月，云南省公安厅制定了《云南省工业用大麻管理暂行规定》，规定THC含量小于0.3%的大麻品种为允许种植的工业大麻。工业大麻不具备毒品利用价值，是经典的生产资料，广泛应用于纺织、造纸、食品、医药、卫生、日化、皮革、汽车、建筑、装饰、包装等领域。因此，有必要建立大麻植物中THC、CBD和CBN的定性定量分析方法，其中对THC的准确定量尤为重要。目前，国内外关于THC、CBD与CBN的检测方法主要有气相色谱-质谱联用（GC-MS）、液相色谱-质谱联用（LC-MS）、气相色谱-火焰离子化检测器（GC-FID）、高效液相色谱（HPLC）法等［2-4］。本研究采用通用型C18反相柱和DAD检测器，拟建立较为简便、快速、准确地测定大麻植物中THC、CBD与CBN的反相HPLC方法。

1　材料与方法

1.1仪器与试剂

仪器：Agilent 1100高效液相色谱检测仪（包括G1311A四元泵、G1315B-DAD阵列二极管检测器、HP色谱工作站，美国安捷伦公司），Millipore超纯水系统（美国Millipore公司）。

药品与试剂：甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）均购自美国Fisher公司，超纯水（电阻＞18MΩ）由Millipore超纯水系统制得，THC、CBD和CBN对照品（1.0mg/mL，0.3 mL/支）均购于北京芬格尔安科技有限责任公司，其余试剂均为国产分析纯。

1.2色谱条件

色谱柱为 Agilent ZORBAX SB-C18柱（150× 4.6mm，5μm，美国安捷伦公司），流动相为V（乙腈）∶V（KH2PO4缓冲液）=75∶25，流速为1.0mL/min，柱温为25℃，检测波长为220nm，同时收集190～400nm全光谱，进样量为10μL。

1.3标准品、缓冲溶液及样品配制

标准品制备：精密吸取THC、CBD和CBN对照品（1.0mg/mL）200μL于2mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度线，混匀，制成质量浓度均为0.1 mg/mL的储备液，4℃冰箱备用。

磷酸盐缓冲液制备：准确称取KH2PO41.020g于500mL容量瓶，用超纯水定容至刻度线并混匀，即得0.015mol/L KH2PO4溶液，然后用磷酸调节pH值至4.0。

样品制备：将大麻样品研磨呈粉末状，精密称取200mg，共3份，加入8mL V（环己烷）∶V（乙酸乙酯）= 9∶1，超声10 min，浸泡30 min后，离心取上清液于10 mL棕色容量瓶中，加V（环己烷）∶V（乙酸乙酯）= 9∶1溶液定容至10mL，摇匀，备用。

2　结果与讨论

2.1检测波长的选择

THC与CBD的紫外光谱图相似，吸收峰位于209nm附近，CBN有两个吸收峰分别位于220、285nm处（图1）。由于209nm处于吸收末端，干扰较大，为了兼顾检测灵敏度及色谱图基线，本实验选择了CBN的吸收峰220nm为检测波长。实验证实220nm为检测波长时，三者灵敏度佳，基线平稳，故本实验选择220nm为检测波长。

2.2流动相优化试验

以乙腈-KH2PO4缓冲液作为流动相，考察不同浓度（0.015、0.02、0.03mmol/L）和不同 pH值（3.0、4.0、5.0）的缓冲液对THC、CBD及CBN测定的影响。在选定范围内不同浓度及pH值的缓冲液盐对THC、CBD 及CBN的对称因子、分离度均无明显影响。于是本研究选定缓冲液为0.015mmol/L KH2PO4溶液，用磷酸溶液调节pH值至4.0。

考察V（乙腈）∶V（磷酸盐缓冲液）不同体积比（80∶20、75∶25、70∶30）对目标物测定的影响。当流动相为 V（乙腈）∶V（磷酸盐缓冲液）=75∶25，流速为1.0mL/min时，THC、CBD、CBN三者保留时间适宜，分离度达1.5，且15 min内可以完成单个样品的测定（图2）。故最后选定V（乙腈）∶V（磷酸盐缓冲液）= 75∶25作为分析流动相。

2.3标准曲线的制作

用磷酸盐缓冲液稀释THC、CBD和CBN储备液，配成质量浓度分别为0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、10.0、16.0、28.0、40.0μg/mL的系列标准溶液。分别取不同浓度标准溶液10μL进样，记录相应的峰面积，并对色谱峰面积（y）及质量浓度（x）（μg/mL）进行线性回归，分别得THC的回归方程为：y=45.202 x+7.193，R2=0.999 8，检测限为1.8 ng（S/N≥3）；CBD的回归方程为y=47.562 x+22.256，R2=0.999 5，检测限为2.0 ng （S/N≥3）；CBN的回归方程为：y=46.826 x+25.351，R2=0.9993，检测限为1.3ng（S/N≥3）。将标准曲线最低质量浓度0.4 μg/mL稀释10倍后分析，以信噪比（S/N≥3）计算检出限。

2.4日内、日间精密度

取高、中、低三种浓度的THC、CBD和CBN按上述色谱条件分别于1d内测定6次，连续测定6d，测得峰面积，日内和日间精密度结果见表1。

表1　THC、CBD和CBN测定的精密度（n=6）

2.5回收率实验

分别加入高、中、低三个质量浓度的THC、CBD 和CBN标准品溶液（各6份）于空白树叶样品（空白对照）中，用本实验方法进行测定，求得THC、CBD和CBN三种质量浓度的平均回收率，结果见表2。

2.6实际应用

云南省农业科学院经济作物研究所为培育工业大麻，送检其培育的编号1～9号的大麻植物干燥叶样品进行THC含量分析。将送检大麻叶样品用本研究建立的方法处理后进样测定，结果送检9份大麻叶样品均检出THC、CBD和CBN，其中THC的含量见表3。编号2、3、4、5、7、9样品的THC含量小于0.3%为工业大麻。

表2　THC、CBD和CBN提取回收率（n=6，μg/mL）

表3　大麻叶样品的THC含量

3　结论

本实验采用反相HPLC法测定大麻中THC、CBD 和CBN的含量，适用于同时分析大麻植物中THC、CBD和CBN。

［1］王继芬.大麻毒品滥用与检验［M］.北京：中国人民公安大学出版社，2009.

［2］Gambaro V，Dell’Acqua L，Farè F，et al.Determination of primary active constituents in Cannabis preparationsbyhigh-resolutiongaschromatography/flame ionization detection and high-performance liquid chromatography/UV detection［J］.Analytica Chimica Acta，2002，468（2）：245-254.

［3］牛勇，卢延旭，刘媛.大麻毒品的检验方法综述［J］.刑事技术，2004，（6）：21-23.

［4］张岗，郭江宁，毕开顺.高效液相色谱法测定火麻仁油中Δ9-四氢大麻酚的含量［J］.沈阳药科大学学报，2003，20（4）：269-271.

（本文编辑：严慧）

Simultaneous Determination of Three Kinds of Effective Constituents in Cannabis Plants by Reversed-phase HPLC

FU Qiang1，SHU Zhi2，DENG Ke1，LUO Xuan1，ZENG Chang-guang1
（1.Criminal Police Branch，Deyang Public Security Bureau，Deyang 618000，China；2.Lincang Public Security Bureau，Lincang 677000，China）

Objective To establish a high performance liquid chromatographic（HPLC）method for simultaneous determination of three effective constituents，including tetrahydrocannabinol（THC），cannabidiol （CBD）and cannabinol（CBN）in Cannabis plants.Methods A C18column was used in this study，and acetonitrile-phosphate buffer（0.015mol/L KH2PO4）was used as mobile phase at a flow rate of 1.0mL/min. At a detection wavelength of 220mm，UV absorption spectra were collected at the wavelength range of 190-400 nm，and the spectra and retention time were counted as qualitative evidence.Results THC，CBD and CBN could be well separated by this method.Three components had good linear relationship in the range of 0.4-40μg/mL（R2≥0.999 3）.The recoveries were over 87%.The limits of detection were 1.8ng，2.0ng and 1.3ng，respectively.The relative standard deviation（RSD）were less than 5%for both inter-day and intra-day precisions.Conclusion Reversed-phase HPLC method is simple，rapid and accurate，and it is suitable for the qualitative and quantitative detection of THC，CBD and CBN in Cannabis plants.

forensic toxicology；high performance liquid chromatography；Cannabis；tetrahydrocannabinol；cannabidiol；cannabinol

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2016.04.006

1004-5619（2016）04-0261-03

傅强（1981—），男，硕士，工程师，主要从事毒物毒品检验；E-mail：qiang4303@sina.com

2015-02-03）