应用微生物菌群鉴定阴道分泌液

邹凯南，胡　萌，黄江平，周怀谷（.上海市公安局物证鉴定中心 法医物证学现场应用技术公安部重点实验室 上海市现场物证重点实验室，上海 00083；.铁道警察学院，河南 郑州 450053）

应用微生物菌群鉴定阴道分泌液

邹凯南1，胡萌2，黄江平1，周怀谷1
（1.上海市公安局物证鉴定中心 法医物证学现场应用技术公安部重点实验室 上海市现场物证重点实验室，上海 200083；2.铁道警察学院，河南 郑州 450053）

目的 探究特异性存在于阴道分泌液中的微生物菌群。方法 收集阴道分泌液16份、唾液样本16份、粪便样本16份、精液样本8份、外周血样本8份、尿液样本5份及鼻腔分泌液样本4份，对卷曲乳杆菌、加氏乳杆菌、詹氏乳杆菌、惰性乳杆菌和阿托波氏菌的16S rRNA基因进行扩增，PCR产物采用3130xl型遗传分析仪进行检测。结果 卷曲乳杆菌、加氏乳杆菌、詹氏乳杆菌、惰性乳杆菌和阿托波氏菌在阴道分泌液中的检出份数分别为15、5、8、14和3份。卷曲乳杆菌和詹氏乳杆菌特异性存在于阴道分泌液中。

结论 检测卷曲乳杆菌和詹氏乳杆菌对鉴定阴道分泌液具有潜在的应用价值。

法医遗传学；微生物学；遗传标记；阴道分泌液

DNA检验技术一直是法医学研究的前沿领域，DNA检验结果也是锁定嫌犯、辅助法庭对嫌犯定罪量刑的重要证据之一，但对于一个犯罪现场，我们更希望了解嫌犯的作案过程，常规的DNA检验技术无法实现，而人体生物性物质来源鉴定对作案过程的重建具有重要意义。例如性侵案件中，从男性阴茎上检测到受害人阴道分泌液物质即可证明嫌犯的性侵行为，因此找到女性阴道分泌液中特异性遗传标记物质实现阴道分泌液的来源鉴定是此类工作的核心。

阴道分泌液由女性的前庭大腺、子宫颈腺体、子宫内膜的分泌物，阴道黏膜的渗出液，脱落的阴道上皮细胞以及微生物菌群混合而成。正常女性阴道中可分离出20余种微生物，平均每个妇女可分离出6～8种微生物，阴道正常菌群包括：（1）革兰氏阳性需氧菌及兼性厌氧菌（乳杆菌、棒状杆菌、非溶血性链球菌、肠球菌及表皮葡萄球菌）；（2）革兰氏阴性需氧菌及兼性厌氧菌（加德纳菌、大肠埃希菌及摩根菌）；（3）专性厌氧菌（消化球菌、消化链球菌、类杆菌、动弯杆菌、梭杆菌及普雷沃菌）；（4）支原体及假丝酵母菌。多种微生物菌群在阴道中保持生态平衡，使阴道免受外源病原体的入侵从而保持阴道健康。国外法医学工作者对阴道分泌液中特异性微生物菌群研究［1-4］较多，但国内相关报道较少。本研究以中国汉族无关个体来源的样本为研究对象，对阴道分泌液、唾液、粪便、精液、外周血、尿液及鼻腔分泌液中微生物菌群的种类和分布特征进行探索，旨在筛选出汉族女性阴道分泌液中的特异性微生物菌群，并以此为标志鉴别阴道分泌液。

1　材料与方法

1.1样本

73份DNA样本取自中国汉族无关个体（年龄22～45岁），包括16份女性阴道分泌液样本、16份唾液样本、16份粪便样本、8份精液样本、8份外周血样本、5份尿液样本和4份鼻腔分泌液样本。每份样本用无菌棉签采集，室温条件下阴干后置于-20℃保存。所有样本由上海市第一人民医院检验科提供，均取得观察对象的知情同意。

1.2DNA提取

每份无菌棉签剪取3mm×3mm作为检测样，微生物菌群DNA的提取和纯化采用QIAamp®DNA Mini试剂盒（德国QIAGEN公司），操作按说明书进行。为充分裂解微生物细胞壁，每个反应体系加入200U/mL变溶菌素50μL和20mg/mL溶解酵素50μL（美国Sigma公司）对检材进行前期孵育，孵育条件为50℃ 60min。

1.3PCR扩增和结果检测

本研究选取国外研究报道较多的卷曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus）、加氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）、詹氏乳杆菌（Lactobacillus jensenii）、惰性乳杆菌（Lactobacillus iners）和阿托波氏菌（Atopobium vaginae）作为研究对象，扩增目的基因为微生物菌群的16S rRNA基因，并采用6-FAM荧光标记其上游引物5′端，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列特征见表1。

表1　阴道微生物菌群16S rRNA基因的引物序列

PCR反应体系为25 μL：Identifiler®Plus试剂盒（美国AB公司）缓冲液10μL，10μmo/L引物1～5μL，模板DNA 2 μL，双蒸水8～12 μL。PCR扩增使用9700型PCR扩增仪（美国AB公司）。热循环参数：95℃ 11 min；94℃ 30 s，52～60℃ 30 s，72℃ 30 s，35个循环；72℃ 10min。扩增产物用3130xl型遗传分析仪（美国AB公司）进行毛细管电泳检测。

1.4灵敏度检测

利用实时荧光定量PCR技术对倍比稀释浓度卷曲乳杆菌和詹氏乳杆菌的DNA提取产物进行定量，并对已测DNA浓度的样本通过3130xl型遗传分析仪进行毛细管电泳检测，以是否出现信号峰来检测两种微生物菌群的检测灵敏度。探针采用Oligo Primer Analysis Software Version 7（美国Molecular Biology Insights公司）软件进行设计，卷曲乳杆菌16S rRNA基因的探针为5′6-FAM-CGGATGGGTGAGTAAC ACG-BHQ1 3′，詹氏乳杆菌16S rRNA基因的探针为5′6-FAM-CAGATGCTAATACCGGATAAAAGCTACT TTCG-BHQ1 3′。

PCR反应体系为50μL：1×Real-time PCR Master Mix（日本TOYOBO公司）25μL，10μmol/L的寡核苷酸引物2 μL（上游和下游），5 μmo/L探针2 μL，模板DNA 5 μL，双蒸水16 μL。选择QuantifilerTMHuman DNA定量试剂盒（美国AB公司）中的Quantifiler® Duo DNA Standard作为DNA定量标准品。PCR扩增使用7500型实时荧光定量PCR仪（美国AB公司）。热循环参数：95℃ 1 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，40个循环。其中卷曲乳杆菌和詹氏乳杆菌各选取3份DNA样本扩增，每份DNA样本稀释7～10个梯度以检测微生物菌群的扩增灵敏度。

1.5STR分型

对本研究所提取的73份中国汉族无关个体DNA样本采用Identifiler®Plus试剂盒（美国AB公司）进行人类常染色体STR分型［3］。使用9700型PCR扩增仪（美国AB公司）进行扩增，在3130xl型遗传分析仪上进行电泳检测。

2　结　果

2.1特异性检测结果

通过检测16S rRNA基因是否存在，间接检测卷曲乳杆菌、加氏乳杆菌、詹氏乳杆菌、惰性乳杆菌和阿托波氏菌在阴道分泌液、唾液、粪便、精液、外周血、尿液（男、女）及鼻腔分泌液中的分布特征（表2）。结果显示，卷曲乳杆菌、加氏乳杆菌、詹氏乳杆菌、惰性乳杆菌和阿托波氏菌在阴道分泌液中的检出份数分别为15、5、8、14和3。詹氏乳杆菌特异性存在于阴道分泌液中；卷曲乳杆菌同时存在于阴道分泌液和女性尿液中；加氏乳杆菌、惰性乳杆菌和阿托波氏菌同时存在于阴道分泌液和其他多种人体生物性物质中，特异性较差。

表2　五种微生物菌群16S rRNA基因在人体各生物性物质中的检出情况　（份）

2.2灵敏度检测结果

3份DNA提取样本稀释的质量浓度分别为0.098～6 424、0.038～2 492、0.135～8 864 pg/μL，卷曲乳杆菌的检出质量浓度分别为0.392、0.152、0.541pg/μL，平均检测灵敏度为0.362pg/μL；另3份DNA提取样本稀释的质量浓度分别为0.067～1088、0.107～438.272、0.013～213 pg/μL，詹氏乳杆菌的检出质量浓度分别为0.268、0.428、0.052 pg/μL，平均检测灵敏度为0.249pg/μL。

2.3STR检测结果

73份DNA提取样本采用Identifiler®Plus试剂盒（美国AB公司）均可成功进行人类常染色体STR分型检测。

3　讨　论

本研究以卷曲乳杆菌、加氏乳杆菌、詹氏乳杆菌、惰性乳杆菌和阿托波氏菌为研究对象，通过检测各微生物菌群16S rRNA基因在阴道分泌液、唾液、粪便、精液、外周血、尿液及鼻腔分泌液共73份中国汉族无关个体样本中的分布特征，探究特异性存在于阴道分泌液中的微生物菌群，以期达到鉴定阴道分泌液的目的。结果显示，卷曲乳杆菌和詹氏乳杆菌特异性存在于阴道分泌液中，而加氏乳杆菌、惰性乳杆菌和阿托波氏菌在阴道分泌液和其他人体生物性物质中均存在，此检测结果与Akutsu等［3］报道的相一致。卷曲乳杆菌和詹氏乳杆菌在16份阴道分泌液中的检出份数分别为15和8，即在阴道分泌液中存在检测不到卷曲乳杆菌或詹氏乳杆菌的情况，因此，卷曲乳杆菌和詹氏乳杆菌检测的阳性结果可以确定为阴道分泌液，阴性结果则不能排除为阴道分泌液。此外，笔者发现卷曲乳杆菌同时存在于阴道分泌液和女性尿液中，这很可能由于女性尿道紧邻阴道导致的污染。本研究选择实验室日常用于人类DNA提取的QIAamp®DNA Mini试剂盒进行微生物菌群DNA提取，操作步骤均按照说明书进行，只是在提取前加入变溶菌素和溶解酵素孵育检材以充分裂解微生物细胞壁，73份样本均成功获得人类常染色体STR分型结果。此法不仅实现了人类DNA和微生物DNA的共提取，提高提取效率，同时也起到节约检材的作用。

本研究对利用微生物菌群鉴定阴道分泌液作了初探，但要用于法医学实践还需要更多的研究和探讨，如人体生物性物质中的微生物菌群是否会因为生活环境、年龄以及身体状态等存在数量或种类的变化，不同温、湿度或极端条件下的检材检测结果如何，阴道分泌液中是否存在更多的特异性微生物菌群等。另外，逐个微生物菌群的检测给阴道分泌液来源鉴定带来一定的工作量，将各微生物菌群整合在一起联合鉴定其来源才是未来的发展方向。

［1］Giampaoli S，Berti A，Valeriani F，et al.Molecular identification of vaginal fluid by microbial signature［J］. Forensic Sci Int Genet，2012，6（5）：559-564.

［2］Fleming RI，Harbison S.The use of bacteria for the identification of vaginal secretions［J］.Forensic Sci Int Genet，2010，4（5）：311-315.

［3］Akutsu T，Motani H，Watanabe K，et al.Detection of bacterial 16S ribosomal RNA genes for forensic identification of vaginal fluid［J］.Leg Med（Tokyo），2012， 14（3）：160-162.

［4］Haas C，Hanson E，Anjos MJ，et al.RNA/DNA coanalysis from human menstrual blood and vaginal secretion stains：results of a fourth and fifth collaborative EDNAP exercise［J］.Forensic Sci Int Genet，2014，8（1）：203-212.

［5］Zozaya-Hinchliffe M，Lillis R，Martin DH，et al. Quantitative PCR assessments of bacterial species in women with and without bacterial vaginosis［J］.J Clin Microbiol，2010，48（5）：1812-1819.

［6］Yan DH，Lü Z，Su JR.Comparison of main lactobacillus species between healthy women and women with bacterial vaginosis［J］.Chin Med J（Engl），2009，122（22）：2748-2751.

［7］De Backer E，Verhelst R，Verstraelen H，et al.Quantitative determination by real-time PCR of four vaginalLactobacillus species，Gardnerellavaginalisand Atopobiumvaginaeindicatesaninverserelationship between L.gasseri and L.iners［J］.BMC Microbiology，2007，7（25）：1-13.

（本文编辑：李莉）

Identification of Vaginal Fluid Using Microbial Signatures

ZOU Kai-nan1，HU Meng2，HUANG Jiang-ping1，ZHOU Huai-gu1
（1.Shanghai Key Laboratory of Crime Scene Evidence，Key Laboratory of Forensic Evidence and Science Technology，Ministry of Public Security，Institute of Forensic Science，Shanghai Public Security Bureau，Shanghai 200083，China；2.Railway Police College，Zhengzhou 450053，China）

Objective To investigate the specific microbial signatures in vaginal fluid.Methods Vaginal fluid（16 samples），saliva（16 samples），feces（16 samples），semen（8 samples），peripheral blood （8 samples），urine（5 samples），and nasal secretion（4 samples）were collected respectively.The 16S rRNA genes of Lactobacillus crispatus，Lactobacillus gasseri，Lactobacillus jensenii，Lactobacillus iners，and Atopobium vaginae were amplified.PCR production was detected via a 3130xl Genetic Analyzer.Results The detected number of Lactobacillus crispatus，Lactobacillus gasseri，Lactobacillus jensenii，Lactobacillus iners，and Atopobium vaginae were 15，5，8，14，and 3 in all vaginal fluid samples，respectively.Lactobacillus crispatus and Lactobacillus jensenii existed specifically in vaginal fluid.Conclusion There is a potential application value to detect Lactobacillus crispatus and Lactobacillus jensenii for the identification of vaginal fluid.

forensic genetics；microbiology；genetic markers；vaginal fluid

DF795.2

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2016.04.004

1004-5619（2016）04-0254-03

公安部科技强警基础工作专项（2016GABJC42）；上海市科学技术委员会科研计划项目（14JG0500400）

邹凯南（1983—），女，硕士，主检法医师，主要从事法医DNA分析技术的应用和研究；E-mail：kitty_zkn@126.com通信作者：周怀谷，男，博士，主任法医师，主要从事法医DNA分析技术的应用和研究；E-mail：hgzhou803@hotmail.com

2016-02-17）