牛流行热病例的综合诊断及预警防控

杜培杰　程子龙　刘玮孟　王军一　张 静　王方昆　刘思当*（山东省临沂市畜牧站　2760372　山东农业大学动物科技学院　山东 泰安　山东省临沂市动物疫病预防控制中心　山东省临沂市罗庄区沂党镇政府）

牛流行热病例的综合诊断及预警防控

杜培杰①①程子龙①刘玮孟③王军一①张 静④王方昆①刘思当①*
（①山东省临沂市畜牧站2760372①山东农业大学动物科技学院山东 泰安③山东省临沂市动物疫病预防控制中心④山东省临沂市罗庄区沂党镇政府）

2015年9月山东某肉牛场从吉林一次性购牛300多头，到场后先后出现30头5月龄犊牛精神沉郁、食欲不振、高烧不退、咳嗽气喘，起初治疗效果不明显，最终由于呼吸困难导致8头犊牛死亡。通过病理剖检、病理组织学观察、分子生物学检测，最终确诊为牛流行热继发巴氏杆菌感染，该牛场做了充分的生物安全措施，控制了牛流行热疫情。这是继2013年以来山东地区又一次发现牛流行热病例，引起了当地畜牧管理部门和牛场的高度重视并采取相应的预警防控措施，未使疫情扩散蔓延。

牛流行热，是由牛流行热病毒引起的一种牛和水牛的急性热性传染病，又名暂时热、三日热、僵硬病。本病的临床特征为突发高热、呼吸促迫、流泪、流泡沫性涎、消化机能障碍、全身虚弱、僵硬、跛行，多为良性经过，大部分患病牛经2～3d即可恢复正常［1］。该病传播迅速，流行面广，有一定的周期性，曾在我国多个省份多次发生流行，导致产奶量下降，乳品质降低，役用牛跛行或瘫痪，部分怀孕牛流产，给养牛业造成重大经济损失，严重威胁养牛业健康发展［2］。该病临床病例常表现为流行热继发细菌感染，尤其是巴氏杆菌，特征为发病急、发病快，往往来不及治疗就出现死亡，大部分病牛经及时治疗可以耐过，但部分病牛则很难治愈，转为慢性肺炎，生长缓慢。

1　临床背景

山东菏泽某肉牛场从吉林地区一次性购牛300多头，其中包括母牛、架子牛和犊牛，经过25h的长途运输到达山东菏泽地区，到场后30头5月龄的犊牛先后出现咳嗽、气喘、持续高烧，体温高达42℃，精神沉郁，食欲减退，起初治疗效果不明显，最终因呼吸困难而窒息死亡8头犊牛。

2　诊断方法

2.1细菌分离培养把采取的肺脏、喉头等病料，用平板划线法［3］接种血琼脂平板，放37℃恒温箱培养24h。挑取单个菌落，涂片，革兰氏染色，油镜下观察。

2.2药物敏感试验用圆纸片扩散试验法［4］进行药敏试验，分别挑取单个菌落用灭菌的PBS稀释，稀释好后用涂布棒在血琼脂平板上均匀涂布，然后均匀贴上头孢噻呋钠、盐酸环丙沙星、左氧氟沙星、乳酸恩诺沙星、庆大霉素、林可霉素、罗红霉素药敏片，于37℃恒温箱培养18～24h，观察结果，根据药物纸片周围有无抑菌圈及其直径大小，来判定该菌对各种药物的敏感程度。

2.3病理组织学检查取肺组织于10%福尔马林溶液固定，常规石蜡切片，HE染色，光镜下观察。

2.4分子生物学检测按照病毒 RNA提取试剂盒说明书，从肺组织和喉头黏液中提取病毒总RNA，用全式金一步法RT-PCR试剂盒进行反转录和PCR反应，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外照胶仪下观察结果，分别检测牛流行热病毒、牛副流感Ⅲ型病毒。

3　结果

3.1剖检病变剖检其中的三头病死牛后发现胸腔内有大量淡黄色澄清积液，其中两头病牛胸腔内有大量纤维素性渗出物，肺和胸腔粘连，肺暗红色实变，并见严重的间质性肺气肿、水肿，肺间质增宽，有大量胶冻样渗出物（图1A）；因喉头黏膜显著肿胀挤压气管导致气管腔极度狭窄（图1B左侧为正常喉头，右侧喉头黏膜显著肿胀），形成典型的巴氏杆菌引起的“锁喉风”症状。

3.2细菌学及药物敏感试验结果从喉头黏膜处分离到红色的两端钝圆着色较深的的革兰氏阴性菌（疑似巴氏杆菌）和蓝紫色球形堆积成葡萄串状的革兰氏染色阳性菌（疑似葡萄球菌）如图2。药敏试验结果表明，分离到的这些细菌对左氧氟沙星、乳酸恩诺沙星高敏，盐酸环丙沙星、罗红霉素中敏，头孢噻呋钠、庆大霉素、林可霉素不敏感。

图2 油镜下细菌形态

图1　剖检病变（A∶肺脏水肿，充满胶冻样渗出物；B∶喉头黏膜肿胀）

3.3病理组织学病理组织学观察发现肺组织结构破坏，肺组织中散在许多化脓灶，肺泡腔内有大量纤维素性渗出物和中性粒细胞（图3A）；细支气管腔中充满中性粒细胞、脱落的黏膜上皮细胞（图3B）；肺化脓灶部位可见组织坏死崩解和大量浸润的嗜中性粒细胞，周围被结缔组织包绕形成包囊（图3C）；有的化脓灶以细支气管腔为中心，细支气管腔内有大量均质红染脓汁（图3D）；大部分肺组织呈浆液性肺炎病变，肺泡腔内充满浆液性渗出物和淋巴细胞，并见肺泡性气肿（图3E）；小叶间淋巴管和支气管高度扩张（图3F）；有的肺泡腔内有浆液纤维素性渗出物，淋巴细胞、巨噬细胞浸润（图3G）；肺间质增宽、水肿、炎性细胞浸润（图3H）；支气管周围有大量浆液性渗出物和淋巴细胞浸润，支气管腔受挤压皱缩（图3I）。

图3　病理组织学切片（A.肺泡腔内纤维素渗出物和中性粒细胞200×；B.细支气管腔内充满中性粒细胞、脱落的黏膜上皮细胞200×；C.化脓灶100×；D.以细支气管腔为中心的化脓灶40×；E、F.浆液性肺炎及肺泡气肿200×；G.肺泡腔内浆液纤维素性渗出物，淋巴细胞、巨噬细胞浸润200×；H.肺间质水肿增宽100×；I.支气管周围大量浆液和淋巴细胞浸润，支气管腔受挤压皱缩40×）

3.4分子生物学结果M为2000bp Marker，+、—分别为牛流行热病毒阳、阴性对照，1、2是牛副流感Ⅲ型病毒，3、4是牛流行热病毒，牛流行热病毒的片段大小是524bp（图4），从琼脂糖凝胶电泳图中可以看出牛副流感Ⅲ型病毒阴性，牛流性热病毒阳性。

图4　琼脂糖凝胶电泳图

3.5结论结合细菌学、病理组织学、分子生物学方法检测结果综合判定，该病例的原发病为牛流行热并继发巴氏杆菌等细菌感染。

4　防控措施

（1）及时对病死牛进行无害化销毁处理，每天两次对牛舍、水槽、料槽进行全面彻底消毒，不留死角；密切关注牛群状况，每天对全群牛进行体温测量，发现有咳嗽气喘以及体温升高的牛及时隔离观察。（2）对疑似发病牛采取积极的治疗措施，对咳嗽气喘的牛用左旋氧氟沙星静脉注射，肌肉注射庆大霉素或大观霉素-林可霉素合剂，并配合应用氨基比林，饮水中添加维生素C。另外，对未发病的牛尤其是周围受到威胁的牛群紧急免疫流行热灭活疫苗［5］。（3）该病确诊后，及时向当地畜牧兽医局上报了疫情，业务部门对牛群疫情进行了密切监控，封锁牛场，严禁流通，并对牛场内外进行全面严格的消毒，从而使该病得到了很好的控制，在周边地区没有发现流行热病例。此次在山东省菏泽地区发生的流行热是继2013年流行以来的再次发生［6］，引起了菏泽畜牧部门的足够重视，对菏泽及周边地区养牛场及时通报了疫情，建议牛场密切关注牛群有无高热等异常表现，发现异常情况，及时采取防控措施，从而防止了本病的传播，减少了不必要的损失。（4）本次发生的流行热疫情很显然是因异地调牛而发生的输入性病例，发病原因可能是该牛群本身携带流行热病毒处在稳定期或者潜伏期，经长途运输、环境改变等应激因素诱发了本病的发生［7］。从未发病牛群中检出该病是很困难的，何况异地调牛时一般都不进行相关疫病的严格检疫，这就为山东地区主要依赖从外地调牛育肥模式敲响了警钟，应尽量从本地繁育牛场调牛或者发展自繁自养模式，避免“引狼入室”或因长途运输应激而诱发牛的呼吸系统疫病［8］。

［1］Walker P J. Bovine ephemeral fever in Australia and the world［M］//The World of Rhabdoviruses. Springer Berlin Heidelberg， 2005∶57-80.

［2］Yeruham I， Van Ham M， Bar D， et al. Economic aspects of the 1999 outbreak of bovine ephemeral fever in dairy S cattle herds in the Jordan Valley in Israel［J］. Veterinary record， 2003， 153（6）∶ 180-182.

［3］周德庆， 张文治， 强义国. 平板划线法分离微生物纯种的一个经验［J］. 生物学教学， 1981， 01∶ 28-29.

［4］刘从森， 胡小冬， 管俊昌. 药物敏感试验方法学概述［J］. 中国病原生物学杂志， 2010， 12∶ 951-952.

［5］谷根林， 杨宗照， 蒋建一等. 牛流行热疫苗对奶牛的免疫保护试验［J］. 杭州农业科技， 2002， Z1∶ 88-89.

［6］岳瑞超， 刘立涛， 屈亚锦等. 牛流行热病例的综合诊断［J］. 中国兽医杂志， 2015， 02∶ 37-39+52.

［7］岳瑞超， 程子龙， 刘思当. 架子牛选购与运输技术［J］. 山东畜牧兽医， 2014， 11∶ 14-15.

［8］刘思当， 程子龙， 毕云霞等. 山东省肉牛养殖现状调查分析［J］. 山东畜牧兽医， 2014， 12∶ 53-56.

S858.23文献标识码：B

1007-1733（2016）08-0026-03

山东省牛产业技术体系资助（SDAIT-12-011-04）

2016-07-18）