超声预处理对脱脂小麦胚芽酶解制备ACE抑制肽的影响

毛　丽,马海乐,潘忠礼,徐康康,王禹程

(江苏大学食品与生物工程学院,江苏省农产品物理加工重点实验室,江苏镇江 212013)



超声预处理对脱脂小麦胚芽酶解制备ACE抑制肽的影响

毛丽,马海乐*,潘忠礼,徐康康,王禹程

(江苏大学食品与生物工程学院,江苏省农产品物理加工重点实验室,江苏镇江 212013)

为了研究不同工作模式超声预处理对脱脂小麦胚芽水解度和ACE抑制率的影响,在相同能耗条件,利用聚能逆流单频、聚能逆流双频、脉冲扫频多频、发散三频、对振双频五种工作模式超声,对脱脂小麦胚芽进行预处理。同时进行单因素实验来寻找最佳超声预处理参数。结果表明,超声波预处理对水解度没有显著的影响,但可以显著提高酶解产物的ACE抑制活性,最佳的超声波工作模式为脉冲平板式40 kHz/28 kHz双频超声;在此模式下超声预处理单位体积超声功率60 W/L、超声时间70 min、超声初始温度60 ℃、底物浓度7%时得到的酶解产物IC50值低至2.483 mg/mL,为较优结果,和未超声相比,其产物IC50值降低了5.8%。

超声波处理,脱脂小麦胚芽,ACE抑制率,酶解

近年来,大量的实验研究发现,利用超声波对蛋白质的预处理,可以显著改善蛋白质的酶解效果[1-3],例如,提高蛋白质的转化率[4]、增加酶解产物的生物活性[5]、缩短蛋白质的酶解时间[6]等。但是,目前诸多研究工作由于实验条件的限制,往往在比较简单的超声波设备上完成,工作模式过于单一,没有条件在工作模式优化的基础上,再进行工作参数优化,因此,难以获得较好的处理效果。

小麦胚芽是面粉工业的副产品,辛志宏[7]以小麦胚芽蛋白为原料,进行了小麦胚芽ACE(Angiotensin I-converting enzyme,血管紧张素转换酶)抑制肽制备技术的研究。之后,贾俊强[8]的研究发现,超声波预处理对小麦胚芽蛋白后续酶解反应有显著的影响,而且扫频多频发散式超声、单频聚能式超声等因为超声波的模式不同,处理效果表现出显著的差异。为了更全面地研究超声波的处理效果,本文进一步将聚能逆流单频、聚能逆流双频、脉冲扫频多频、发散三频、对振双频等五种不同工作模式的超声波设备应用于麦胚蛋白的预处理。聚能逆流单频、聚能逆流双频、脉冲扫频多频、发散三频、对振双频超声在工作原理以及工作模式上有很大不同。聚能逆流单频、聚能逆流双频超声属于探头式超声,即由超声探头发出超声波,超声能量比较集中;脉冲扫频多频、发散三频、对振双频超声属于平板式超声,即由超声板发出超声波,超声能量平均分散分布。聚能逆流单频、聚能逆流双频、对振双频超声只能以定频的模式工作,而脉冲扫频多频、发散三频超声既可以定频的模式工作也可以扫频的模式工作。定频是指超声波的频率固定在中心频率不变;而扫频是指超声波的频率围绕中心频率在一个设定的范围内以一定扫频周期上下波动。本文通过对比研究这五种不同工作模式的超声波设备作用于麦胚蛋白的结果,以期获得最佳的超声波工作模式及其工作参数。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

脱脂小麦胚芽粉河南省鲲华生物技术有限公司;碱性蛋白酶(20万U/mL)诺维信(中国)生物技术有限公司;马尿酰组氨酰亮氨酸(HHL)Sigma公司;氢氧化钠国产分析纯;血管紧张素转化酶(ACE)本实验室自提于猪肺[9]。

聚能逆流单频超声设备、聚能逆流双频超声设备、脉冲扫频多频超声波设备、发散三频超声设备自行研制;XFMR-DRC-4-DPP-HC22-2598超声设备(对振双频)美国进口;岛津LC-20AT液相色谱日本岛津公司;PHS-3C型数显pH计上海鸿盖仪器有限公司;DL-5C型离心机上海安亭科学仪器厂。

1.2实验方法

1.2.1脱脂小麦胚芽酶解工艺称取小麦胚芽粉,按照原料浓度10%配成水溶液,进行超声预处理,处理条件为:单位体积超声功率40 W/L、初始温度25 ℃、超声的工作时间10 s和间歇时间3 s、脉冲超声扫频周期120 ms、超声处理时间30 min。

经超声预处理后的麦胚蛋白用碱性蛋白酶进行酶解,酶解条件如下:加酶量(E/S)1%、pH9.0、温度50 ℃,在酶解90 min后,沸水浴中灭酶10 min,冷却至室温后于5000 r/min离心15 min,取上清液,稀释5倍测定其ACE抑制率。以原料未经超声预处理为对照组。平行实验进行三次。

1.2.2脱脂小麦胚芽的超声波预处理本文拟考察在相同的能耗条件下,以较低超声功率密度的超声波预处理小麦胚芽,确定对小麦胚芽最有效果的一种超声工作模式。所使用的超声设备及其工作模式有以下几种。

聚能逆流单频超声工作模式:20、28、35、40、50 kHz;聚能逆流双频超声工作模式:20/28、20/35、20/40、20/50 (kHz/kHz);脉冲平板单频超声工作模式:定频24、28、33、40、68 kHz,扫频(24±2)、(28±2)、(33±2)、(40±2)、(68±2) kHz;脉冲平板双频超声工作模式:定频24/28、24/40、33/24、33/28、33/40、40/28、68/24、68/28、68/33、68/40(kHz/kHz),扫频(24±2)/(28±2)、(24±2)/(40±2)、(33±2)/(24±2)、(33±2)/(28±2)、(33±2)/(40±2)、(40±2)/(28±2)、(68±2)/(24±2)、(68±2)/(28±2)、(68±2)/(33±2)、(68±2)/(40±2) (kHz/kHz);发散三频超声工作模式:定频20/28/40、20/35/50、20/40/60 (kHz/kHz/kHz),扫频(20±2)/(28±2)/(40±2)、(20±2)/(35±2)/(50±2)、(20±2)/(40±2)/(60±2) (kHz/kHz/kHz);对振双频超声工作模式:20、16 kHz、20/16 (kHz/kHz)。

1.2.3单因素实验本实验是一个双目标实验,以ACE抑制率为主导,但同时也要了解水解度(DH),进行单因素优化,虽然优化得到的条件可能不是最佳的,比正交优化的结果要差一点,但单因素逐级优化实验可以观察到整个过程中的变化,对实验过程更有指导意义,所以在优化得到的一种超声模式条件下,对超声预处理条件进行单因素优化实验,考察单位体积超声功率、超声处理时间、超声初始温度、底物浓度对DH和ACE抑制率的影响,确定最佳的超声预处理工艺，其中固定超声工作时间10 s和间歇时间3 s,超声扫频周期120 ms。

各组单因素实验条件如下:超声处理时间30 min,超声初始温度25 ℃、底物浓度7%,单位体积超声功率取值为40、50、60、70、80、90、100 W/L;单位体积超声功率为前组单因素实验优化值,超声初始温度25 ℃、底物浓度7%,超声处理时间取值为10、20、30、40、50、60、70、80、90 min;单位体积超声功率和超声处理时间为前组实验优化值,底物浓度7%,超声初始温度取值为20、30、40、50、60、70、80 ℃;单位体积超声功率、超声处理时间和超声初始温度为前组实验优化值,底物浓度取值为3%、5%、7%、10%、12%、15%(各不同浓度的预处理小麦胚芽溶液,在酶解前均用蒸馏水稀释至3 g/100 mL)。

以ACE抑制率和水解度(DH)作为考察指标,进行局部优化,得到制备脱脂小麦胚芽ACE抑制肽的较优工艺条件。实验平行三次。

1.2.4水解度测定水解度测定采用pH-stat法[7,10]。水解度(DH)即蛋白质在水解过程中,断裂的肽键数占蛋白质中总肽键的百分数,可用式(1)表示:

式(1)

式中,B-NaOH的消耗量,mL;Nb-NaOH浓度,mmol/mL;Mp-被水解蛋白的质量,g;α-α-NH2在蛋白底物中的平均解离度,pH9.0、50 ℃的实验条件下,1/α为1.01,即本文碱性蛋白酶对蛋白平均解离度为0.99;h-单位质量蛋白质被水解的肽键量,mmol/g;htot-单位质量蛋白质中肽键的总量(mmol/g),对于某一特定蛋白质htot为一固定值,麦胚蛋白的htot=7.69[8]。

1.2.5ACE抑制率测定参考王振斌等[11-12]研究的方法进行测定。准确吸取10 μL样品于1.5 mL离心管中,加入25 μL ACE(1 U ACE溶于10 mL的pH8.3、0.1 mol/L的硼酸缓冲液中,该缓冲液含0.3 mol/L NaCl),37 ℃保温10 min,随后加入6.5 mmol/L的马尿酰-组氨酰-亮氨酸(N-Hippuryl-L-histidyl-L-leucine,HHL)40 μL,在37 ℃恒温反应30 min,然后加入1 mol/L HCl 85 μL终止反应,所得反应液用于HPLC分析。HPLC条件:ZORBAXSB-C18色谱柱(4.6 mm×150 mm,填料粒径5 μm);检测波长228 nm;进样量10 μL;柱温25 ℃;流动相为超纯水-乙腈(75∶25,各含0.5‰三氟乙酸);流速1.0 mL/min。用10 μL pH8.3硼酸缓冲液作空白对照实验。

1.2.6半抑制浓度(IC50)的测定将酶解上清液分别稀释2、3、4、5、6、7倍,测定不同稀释倍数下的ACE抑制率。绘制浓度-抑制率曲线回归方程,通过曲线方程计算抑制率为50%所对应的浓度值,即IC50值[13-14]。以原料未经超声预处理为对照组,计算超声处理对IC50值的影响。

1.3数据处理

实验数据以平均值±标准差表示,采用GraphPad Prism5软件作图,SPSS Statistics17.0软件进行方差分析。

2　实验结果与分析

2.1最优超声工作模式的筛选

2.1.1聚能逆流单频超声波预处理对酶解制备麦胚ACE抑制肽活性的影响聚能逆流单频超声对脱脂小麦胚芽进行预处理,酶解的水解度(DH)及酶解物对ACE的抑制率如图1。

图1　聚能逆流单频超声频率对水解度和ACE抑制率的影响Fig.1　Effects of ultrasonic frequency of energy aggregation,counter flow and single-frequency model on DH and ACE inhibitory activity

聚能逆流单频超声设备各种工作模式对小麦胚芽的水解度影响不大,但对酶解液的ACE抑制率有一定的影响,在28 kHz处理小麦胚芽时,其酶解产物的ACE抑制率最高为65.41%,比对照提高了6.54%。

2.1.2聚能逆流双频超声波预处理对酶解制备麦胚ACE抑制肽活性的影响聚能逆流双频超声对脱脂小麦胚芽进行预处理,酶解的水解度及酶解物对ACE的抑制率如图2。

图2　聚能逆流双频超声频率对水解度和ACE抑制率的影响Fig.2　Effects of ultrasonic frequency of energy aggregation,counter flow and dual-frequency model on DH and ACE inhibitory activity

聚能逆流双频超声设备各种工作模式对小麦胚芽的水解度影响不大,但对酶解液的ACE抑制率有很大的影响。其中,以20 kHz/35 kHz组合处理效果最好,ACE抑制率达64.07%,相比于35 kHz单独处理,ACE抑制率有一定的提高,但相比于28 kHz单独处理时,双频的处理效果不如单频。

在聚能逆流单频超声的基础上,以20 kHz为基频组合形成的聚能逆流双频超声,与单频所对应的各个频率的酶解效果相比,酶解产物的ACE抑制率有的出现增大,有的出现降低,这说明超声波效果不是简单的各种波之间效果的叠加,不同波之间也有交互作用。

图3　脉冲平板单频超声定频(a)和扫频(b)时频率对水解度和ACE抑制率的影响Fig.3　Effects of ultrasonic frequency of pulsed,plate and single-frequency model with(a)fixed and(b)sweeping frequency on DH and ACE inhibitory activity

2.1.3脉冲平板单频超声波预处理对酶解制备麦胚ACE抑制肽活性的影响由图3可知,脉冲平板单频超声设备各种工作模式对小麦胚芽的水解度几乎没有太大影响,但对酶解液的ACE抑制率有很大的影响。经超声预处理后,酶解液ACE抑制率都有所提高,而且无论定频还是扫频,都以28 kHz或(28±2)kHz处理的效果最好,其中又以(28±2)kHz预处理的效果好于以28 kHz处理的效果,ACE抑制率为65.88%,这表明频率为28 kHz的超声波所产生的空化作用最有利于麦胚蛋白结构的改变。

2.1.4脉冲平板双频超声波预处理对酶解制备麦胚ACE抑制肽活性的影响由图4可知，小麦胚芽经过双频超声处理后,其酶解液ACE抑制率得到较大提高,其中,在固定频率组合为40 kHz/28 kHz时,其酶解液的ACE抑制率最高为66.77%,与未超声对照组相比提高了8.76%。

结合图4a和图4b,可以发现,采用固定双板频率处理与双板扫频处理,对酶解液抑制活性的影响是不同的,原因可能是不同频率发出的超声波振幅不同,出现振幅叠加或者振幅削减作用,增大的振幅有利于许多微气泡核合并,使其体积变大,经过挤压破裂,产生强大的剪切力和瞬时高压对麦胚蛋白结构破坏更为剧烈[15]。此外,贾俊强[8]认为在有些频率组合的振板之间可能表现出协同作用,使麦胚蛋白结构容易破坏。麦胚蛋白结构的改变可能造成蛋白分子内部疏水性氨基酸暴露在蛋白表面,容易被蛋白酶切割下来,使酶解产物中疏水性氨基酸含量增加,引起酶解产物的ACE抑制率的增加[16]。

图4　脉冲平板双频超声定频(a)和扫频(b)时频率对水解度和ACE抑制率的影响Fig.4　Effects of ultrasonic frequency of pulsed,plate and dual-frequency model with(a)fixed and(b)sweeping frequency on DH and ACE inhibitory activity

2.1.5发散三频超声波预处理对酶解制备麦胚ACE抑制肽活性的影响从图5可知,发散三频超声设备各种工作模式对小麦胚芽的水解度几乎没有太大影响,但对酶解液的ACE抑制率有轻微的影响。其中,组合20 kHz/28 kHz/40 kHz优于其他组合,酶解液的ACE抑制率提高较多,为63.45%。

图5　发散三频超声定频(a)和扫频(b)时频率对水解度和ACE抑制率的影响Fig.5　Effects of ultrasonic frequency of diverging and triple-frequency model with(a)fixed and(b)sweeping frequency on DH and ACE inhibitory activity

2.1.6对振双频超声波预处理对酶解制备麦胚ACE抑制肽活性的影响对振双频超声预处理对酶解的水解度及酶解物对ACE的抑制率如图6。

图6　对振双频超声频率对水解度和ACE抑制率的影响Fig.6　Effects of ultrasonic frequency of opposite-site and dual-frequency model on DH and ACE inhibitory activity

双频对振超声设备各种工作模式对小麦胚芽的水解度几乎没有太大影响,对酶解液的ACE抑制率也影响微弱,只有在20 kHz/16 kHz超声处理时,酶解液的ACE抑制率才有轻微的提高,而在20 kHz或16 kHz单独超声处理时,酶解液的ACE抑制率相对于不超声对照组没有显著改变。

通过研究不同工作模式下的超声预处理对脱脂小麦胚芽酶解物水解度和ACE抑制率的影响,确定脉冲平板式40 kHz/28 kHz双频超声为最佳的超声波工作模式。下面将采用此模式,进一步优化超声条件。

2.2影响酶解效果的主要因素

2.2.1单位体积超声功率对酶解效果的影响单位体积超声功率对酶解的水解度及酶解物对ACE的抑制率如图7所示。

图7　单位体积超声功率对水解度和ACE抑制率的影响Fig.7　Effects of ultrasonic power per unit volume on DH and ACE inhibitory activity

从图7可以看出,不同超声波功率密度对小麦胚芽的水解度几乎没有太大的影响,其水解度大小均接近20.0%。超声波功率对ACE抑制率有较大的影响,随着超声波功率的增加,ACE抑制率持续增大,在60 W/L时,ACE抑制率达到最高。随着功率进一步增大,ACE抑制率又呈缓慢下降的趋势。在高功率超声波作用后,其ACE抑制率略有下降,其原因在于:声强会随着功率的增大而增加,但是在声强较高时会造成空化泡过多,形成声波屏障,不利于声波传到整个液体空间[17],从而造成在高功率下出现空化相对强度减少的现象,而这可能导致高功率下超声波对麦胚蛋白的空化作用减弱。

尽管超声波处理没有改变水解度,但提高了酶解产物的ACE抑制率,这说明超声波预处理改变了麦胚蛋白的酶解特征,而这种变化或许与麦胚蛋白的结构改变有关,目前已有关于超声波能够改变牛血清蛋白结构的报道[18]。综上认为,单位体积超声功率以60 W/L为宜。

2.2.2超声时间对酶解效果的影响超声时间对酶解的水解度及酶解物对ACE的抑制率如图8所示。

图8　超声时间对水解度和ACE抑制率的影响Fig.8　Effects of ultrasonic time on DH and ACE inhibitory activity

从图8中可以看出,超声波处理时间并没有对水解度产生影响,超声波处理没有使更多的肽键被水解。然而,处理时间对酶解液的ACE抑制率有较大的影响,随着处理时间的增加,ACE抑制率在前50 min呈缓慢增大的趋势;50 min到70 min,ACE抑制率迅速增大并达到最高;随着时间进一步延长,ACE抑制率开始逐渐下降。

较短时间的超声波预处理会使麦胚蛋白结构发生改变,引起表面疏水性增加[18],表面疏水性是由疏水氨基酸引起的,疏水性氨基酸对降血压肽活性具有重要作用[16],故这种适度的变性可能有利于降血压肽的释放。但是当处理时间过长时,会使部分蛋白发生过度变性,蛋白折叠,隐藏了疏水性氨基酸,反而使酶解液的抑制活性降低,因此选择适当的超声波处理时间对于高效制备ACE抑制肽将起到重要的作用。因此,超声处理时间以70 min为宜。

2.2.3超声初始温度对酶解效果的影响从图9可以看出,小麦胚芽溶液的初始温度对水解度几乎没有太大的影响,但对ACE抑制率有较大的影响。在初始温度达到40 ℃以前,改变溶液初始温度对ACE抑制率影响不大;随着初始温度进一步增加,ACE抑制率逐渐增大,在60 ℃时,ACE抑制率达到最高;但初始温度进一步增加,ACE抑制率略微下降。这可能与超声波的特殊作用有关,超声波辐射作用于物料最主要是通过空化作用[19-20]。即料液中微小泡核在超声波作用下通过振荡、生长、收缩及崩溃等一系列变化而产生瞬时高温、高压和剪切力等。初始料液温度低,超声波能大量被料液吸收,使超声波空化作用减弱;而初始料液温度太高,固有的微小泡核由于热作用而从料液中排出,使料液中微小泡核量减小,同样使空化作用减弱,而达不到理想的处理效果。因此,超声初始温度以60 ℃为宜。

图9　超声初始温度对水解度和ACE抑制率的影响Fig.9　Effects of initial temperature in ultrasonic tank on DH and ACE inhibitory activity

2.2.4底物浓度对酶解效果的影响从图10可以看出,不同浓度的小麦胚芽溶液超声波预处理对水解度几乎没有太大的影响,但对ACE抑制率有很大影响。随着溶液浓度的增加,ACE抑制率逐渐增大。在溶液浓度为7%时,ACE抑制率达到最高;随着溶液浓度进一步增加,ACE抑制率开始下降。原因可能为:料液浓度低时,超声波空化作用产生的作用力由于蛋白颗粒稀少而未充分作用在蛋白颗粒上,而适度的料液浓度使蛋白颗粒能够充分接受空化作用力,同时蛋白之间发生强烈的碰撞,提高了超声波对蛋白的空化效果;然而,过高的料液浓度导致料液粘度增加,不利于超声波的传递,影响了空化作用效果[8]。综上认为,底物浓度以7%为宜。

图10　底物浓度对水解度和ACE抑制率的影响Fig.10　Effects of substrate concentration on DH and ACE inhibitory activity

通过上述单因素实验,获得超声预处理小麦胚芽的较优条件为:单位体积超声功率60 W/L、超声波时间70 min、超声初始温度60 ℃、底物浓度7%。在该条件下,酶解产物ACE抑制活性的IC50值为2.483 mg/mL,而无超声预处理的对照组IC50值为2.636 mg/mL,因此超声预处理可以使得IC50降低了5.8%。

3　结论

超声波预处理对小麦胚芽酶解反应的水解度没有显著的影响,而可以显著提高酶解产物的ACE抑制活性,最佳的超声波工作模式是脉冲平板式40 kHz/28 kHz双频超声。

利用脉冲平板式40 kHz/28 kHz双频超声预处理小麦胚芽的较优条件为:单位体积超声功率60 W/L、超声波时间70 min、超声初始温度60 ℃、底物浓度7%。在该条件下,相比于未超声,其酶解产物ACE抑制活性的IC50降低了5.8%。

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Effect of ultrasound pretreatment on enzymatic preparation of ACE-inhibitory peptides from defatted wheat germ

MAO Li,MA Hai-le*,PAN Zhong-li,XU Kang-kang,WANG Yu-cheng

(School of Food and Bioengineering,Jiangsu University,Key Laboratory for Physical Processing of Agricultural Products of Jiangsu Province,Zhenjiang 212013,China)

In order to study the effects of different working mode of ultrasound on the degree of enzymatic hydrolysis and ACE inhibitory activity of defatted wheat germ,five kinds of working mode of ultrasound,energy aggregation counter flow single-frequency ultrasound,energy aggregation counter flow dual-frequency ultrasound,pulsed and sweeping frequency ultrasound,divergence triple-frequency ultrasound and opposite-site dual-frequency ultrasound were used to pretreat of defatted wheat germ under the same condition in this article. The one-factorial experiments were taken to search the best pretreatment parameters of ultrasound.The results illustrated that ultrasound pretreatment had no significant effect on the degree of hydrolysis but could increase the ACE inhibitory activity of enzyme products significantly. The best ultrasonic working mode was 40 kHz/28 kHz pulse plate dual-frequency ultrasound. With this working mode,the enzymatic hydrolysates value of IC50could drop to 2.483 mg/mL under the following optimal ultrasound pretreatment conditions:ultrasonic power per unit volume of 60 W/L,ultrasound time of 70 min,ultrasonic initial temperature at 60 ℃,the substrate concentration 7%. As a better result,the value of IC50decreased by 5.8% compared with control group.

ultrasound pretreatment;defatted wheat germ;ACE-inhibitory;enzymatic hydrolysis

2015-12-25

毛丽(1989-)，女，硕士研究生，研究方向：食品物理加工技术，E-mail：948180359@qq.com。

马海乐(1963-)，男，教授，研究方向：功能食品、食品物理学加工方法及装备的开发研究，E-mail：mhl@ujs.edu.cn。

国家863计划课题(2013AA102203)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)12-0200-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.12.030