戊二胺高通量检测方法的研究

张　弘,马伟超,陈可泉

(南京工业大学生物与制药工程学院,江苏南京 211816)



戊二胺高通量检测方法的研究

张弘,马伟超,陈可泉*

(南京工业大学生物与制药工程学院,江苏南京 211816)

本文以全细胞催化法制备的1,5-戊二胺转化液为检测对象,通过对萃取剂、反应温度和时间进行优化,建立了一种基于分光光度法的高通量生物胺检测方法。结果表明,使用对二甲苯为萃取剂更有利于排除底物L-赖氨酸的影响,1,5-戊二胺与2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)衍生反应的最佳条件为42 ℃,反应6 min。应用该方法建立的标准曲线线性关系良好,相关系数R2为0.9988,线性范围为4.176～20.88 μg。方法学研究表明本方法有较好的精确度(RSD=1.722%)与重现性(RSD=6.414%),其加标回收率为100.5%。本方法操作简单,省时,适用于生物胺的常规快速定量检测。

生物胺,分光光度法,高通量检测

生物胺是一类碱性含氮、具有生物活性的小分子有机物的总称,包括尸胺、组胺、多巴胺等,广泛存在于生物体中,具有重要的生理作用[1],其含量的高低可作为疾病诊断[2]或食品检验[3]的指标。此外,生物胺中的尸胺(1,5-戊二胺)可作为尼龙单体与丁二酸、癸二酸等聚合生成PA5.4、PA5.10等生物尼龙[4],特别是近期利用全细胞转化法生产1,5-戊二胺的研究,使其产量较发酵法有大幅度的提升,具有广阔的工业化前景[5-6]。生物胺的快速、高通量检测在食品安全、疾病诊断以及工业化生产中都具有重要的意义,目前常用的检测方法中液相色谱应用较广泛,回收率可控制在83%～116%[7],但需要对样品进行衍生化处理,过程复杂,耗时较长,样品衍生及检测耗时约1.5 h[8];气相色谱法需要对样品进行预处理,不同生物胺的检测方法通用性较差,且准确性相对较差,部分样品回收率可控制在74%～115%[9];而薄层色谱操作简单,成本低廉,但其通用性较差,且耗时较长,检测全程需1～1.5 h,部分样品回收率可控制在85%～92%[10]。因而都无法满足高通量检测的要求。由于生物胺可以与显色剂TNBS反应,且具有特定的紫外吸收峰[11],因而可应用这一特性,利用分光光度法实现生物胺的高通量定量检测。本文利用分光光度法,以全细胞催化法获得的1,5-戊二胺转化液为研究对象,建立了一种1,5-戊二胺的高通量检测方法。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

戊二胺梯希爱(上海)化成工业发展有限公司;5%(w/v)2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)Sigma公司;L-赖氨酸盐酸盐生工生物工程上海(股份)有限公司;其它试剂均为分析纯 国药集团化学试剂有限公司。

Multiskan GO全波长酶标仪美国赛默飞世尔科技公司;GZX-9140 MBE型电热鼓风干燥箱上海博讯实业有限公司医疗设备厂;UV-star 96孔板德国Greiner Bio-one公司;96孔深孔板生工生物工程上海(股份)有限公司;MS 3数显混匀器德国IKA集团;Multipette M4分液器德国Eppendorf公司。

1.2实验方法

1.2.1溶液的配制标准溶液的配制:分别称取0.1044 g 1,5-戊二胺和0.1100 gL-赖氨酸,配制浓度为20.88 g/L的1,5-戊二胺溶液和22.00 g/L的L-赖氨酸溶液,再将其分别稀释100倍,配制2.088 g/L的1,5-戊二胺标准溶液和2.200 g/L L-赖氨酸标准溶液。10 mol/L TNBS溶液的配制:取5%(w/v)TNBS 294 μL,用超纯水定容于5 mL容量瓶中。

1.2.21,5-戊二胺样品的制备利用全细胞转化法制备1,5-戊二胺样品[5],经HPLC法检测,确定其1,5-戊二胺浓度为2.667 g/L。

1.2.31,5-戊二胺的测定取5 μL的样品,用水补充至50 μL,与50 μL的1 mol/L NaCO3和50 μL的10 mmol/L TNBS在一定温度下反应一定时间;取100 μL冷却后的反应混合物至96孔深孔板中,加入500 μL的甲苯(或对二甲苯)震荡萃取2 min后室温静置分相3 min;分别吸取100 μL上层萃取液和100 μL无水乙醇至UV-star 96孔板中进行混合,利用酶标仪在340 nm下测其吸光度。

1.2.4底物赖氨酸对检测的影响为检验剩余的底物L-赖氨酸对1,5-戊二胺检测的影响,分别制备两组实验样品,其中样品1为含10.44 μg戊二胺的水溶液;样品2包含10.44 μg 1,5-戊二胺及11.00 μg L-赖氨酸。将两份样品按方法1.2.3进行检测(反应温度为42 ℃,反应时间为6 min),分别用甲苯和对二甲苯进行萃取,用酶标仪测其吸光值。

1.2.5反应条件优化反应温度优化:按1.2.3的方法检测1,5-戊二胺在34、38、42、44、46 ℃条件下与TNBS反应6 min后的吸光值变化。反应时间优化:按1.2.3的方法检测1,5-戊二胺在优化后的温度下与TNBS分别反应2、4、6、8、10 min后的吸光值变化。

1.2.61,5-戊二胺标准曲线的建立分别取质量为4.176、8.352、12.528、16.704、20.88 μg的1,5-戊二胺,按1.2.5所确定的方法对各样品的吸光度进行检测,绘制出吸光度-戊二胺质量标准曲线。

2　结果与分析

2.1底物赖氨酸对检测的影响

由于底物L-赖氨酸也可与TNBS反应,其生成的N,N′-双三硝基苯酰赖氨酸(TNP-lysine)在340 nm下也具有紫外吸收[11],但由于TNP-lysine主要溶于水相,而TNBS与1,5-戊二胺的衍生产物N,N′-双三硝基苯酰戊二胺(TNP-cadaverine)溶于有机相,因而通过选择适宜的有机萃取剂,可有效排除底物L-赖氨酸对检测的影响。本实验对比了甲苯和对二甲苯作为萃取剂对检测的影响,结果如图1所示。用甲苯作为萃取剂时,样品1(1,5-戊二胺)和样品2(1,5-戊二胺+L-赖氨酸)的吸光值具有显著差异(p<0.05),而用对二甲苯作为萃取剂时,样品1和样品2的吸光值没有显著差异(p>0.05),说明使用对二甲苯作为萃取剂可以有效排除L-赖氨酸对检测的干扰。

图1　赖氨酸对检测的影响Fig.1　The influence of lysine on the determination of cadaverine

2.2最佳反应温度的确定

在衍生化反应中,温度具有重要影响,其过低或过高都会影响分析效果[12]。本实验取1,5-戊二胺标准溶液5 μL(含1,5-戊二胺10.44 μg),按1.2.3的方法检测在34、38、42、44、46 ℃条件下反应6 min后的吸光值变化。结果表明,在42 ℃下反应物的吸光值最高(如图2所示),说明在42 ℃时1,5-戊二胺与TNBS反应较充分,且形成的络合物也最稳定,因此本方法采用的反应温度为42 ℃。

图2　反应温度的优化Fig.2　The optimization of reaction temperature

2.3最佳反应时间的确定

TNBS与1,5-戊二胺反应时间过短,反应无法充分进行,若反应时间过长,不仅降低实验效率,而且还可能会对产物稳定性产生影响[11]。本实验取1,5-戊二胺标准溶液5 μL(含1,5-戊二胺10.44 μg),按1.2.3的方法在42 ℃分别反应2、4、6、8、10 min。结果表明,反应6 min时反应物的吸光值达到最大值(如图3所示),说明反应6 min时,1,5-戊二胺与TNBS反应比较充分,反应产物也比较稳定。因此本方法采用的反应时间为6 min。

表1　精密度实验Table 1　Results of precision tests

表2　重现性实验Table 2　Results of reproducibility tests

图3　反应时间的优化Fig.3　The optimization of reaction time

2.41,5-戊二胺标准曲线的建立

以1.2.3中的方法为基础,反应温度定为42 ℃,反应时间定为6 min,建立最终的检测方法。运用该方法测定不同质量的戊二胺,结果表明,1,5-戊二胺质量与吸光度具有良好的线性关系,相关系数R2为0.9988,方程为:Y=0.04035X-0.0681,线性范围为4.176～20.88 μg(如图4所示)。

图4　1,5-戊二胺的标准曲线Fig.4　Standard curve of Cadaverine

2.5方法学考察

2.5.1精密度实验取6 μL全细胞转化液样品,按1.2.5所确定的方法进行检测,连续测量6次[13],结果显示精密度实验相对标准偏差(RSD)为1.722%(如表1所示),表明该方法具有良好的精密度。

2.5.2重现性实验同一批次6份样品各取3 μL测量其1,5-戊二胺含量,进行方法的重现性考察[13]。结果表明,重现性相对标准偏差(RSD)为6.414%(如表2所示),表明该方法具有较好的重现性。

2.5.3加标回收率实验取全细胞转化液样品5 μL,向其中加入5 μg 1,5-戊二胺标品,按1.2.5的方法进行检测,连续测量5次,每次测量3个平行样,计算其回收率[14-15]。结果表明,各组的回收率均在95%～105%范围内,平均回收率为100.5%,显示该方法具有较高的准确性(如表3所示)。

表3　回收率实验Table 3　Results of recovery tests

3　结论

本文通过对萃取剂的选择、反应温度和反应时间的优化,建立了一种快速、高通量检测1,5-戊二胺的方法,且有较好的重现性和准确度。在本方法中,最佳反应温度为42 ℃,最佳反应时间为6 min,采用对二甲苯为萃取剂可以有效排除底物L-赖氨酸对检测的影响。吸光度-1,5-戊二胺质量标准曲线的相关系数R2为0.9988,线性范围为4.176～20.88 μg。此外,由于使用了高通量检测仪器,检测效率明显提高,在实际应用中,该方法可以用于全细胞转化液等组分比较单一的样品的定性、定量分析,也可用于食品安全等领域的生物胺初步、快速检测。

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Study on the high-throughput detection of cadaverine

ZHANG Hong,MA Wei-chao,CHEN Ke-quan*

(Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,Nanjing University of Technology,Nanjing 211816,China)

In this paper,to develop a high-throughput bioamine detection method based on spectrophotometry,the cadaverine concentration in a whole-cell bioconversion solution was determined,and the extracting agent,reaction temperature and time were optimized. The results showed that the use of p-xylene as the extraction agent was more conducive to eliminate the influence of theL-lysine on bioamine detection,and the optimal conditions for the derivatization of cadaverine with 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid(TNBS)were 42 ℃ and 6 min. By using this method,a standard curve with a correlation coefficient(R2)of 0.9988 was obtained,and the linear range was 4.176～20.88 μg. The results of validation studies showed that,this method was precise(RSD=1.722%)and reproducible(RSD=6.414%),and the recovery was 100.5%. This method was simple,time-saving and suitable for the conventional rapid quantitative detecting of biogenic amines.

cadaverine;spectrophotometry;high-throughput detection

2015-08-27

陈可泉(1982-)，男，博士，副教授，研究方向：生物催化工程,E-mail:kqchen@njtech.edu.cn。

张弘(1989-)，男，在读硕士研究生，研究方向：分子生物学与发酵工程,E-mail:zh644705227@hotmail.com。

国家自然科学基金(21390200);国家自然科学基金(31440024)；“973”计划(2011CBA00807)；“863”计划(2014AA021703)。

TS207.7

A

1002-0306(2016)05-0283-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.048