响应面优化酶解法制备蒲公英籽蛋白抗氧化肽工艺

张　杨,胡　磊,汪少芸,洪　晶

(福州大学生物科学与工程学院,福建福州 350116)



响应面优化酶解法制备蒲公英籽蛋白抗氧化肽工艺

张杨,胡磊,汪少芸,洪晶*

(福州大学生物科学与工程学院,福建福州 350116)

以蒲公英籽蛋白质抽提物为原料,采用响应面分析法(RSM)优化酶解蒲公英籽蛋白质制备抗氧化肽工艺。采用碱性蛋白酶酶解制备蒲公英籽抗氧化肽,以酶解产物对DPPH自由基清除力为评价指标,考察酶解pH、底物浓度、酶底比及酶解温度对酶解产物抗氧化活性的影响。在单因素实验的基础上,采用三因素三水平的响应面分析法确定酶解蒲公英籽蛋白质制备抗氧化肽工艺,同时建立酶解工艺的二次项数学模型并验证其可靠性。以酶解时间、酶底比和酶解pH为自变量,研究这3个因素的交互作用及最佳酶解工艺条件并进行验证。研究表明,对酶解蒲公英籽蛋白质制备抗氧化肽工艺的影响因素主次顺序为:pH>酶底比>酶解时间,最佳酶解工艺条件:酶解时间 4.90 h,pH8.5和酶底比7.80%。在最佳工艺条件下,酶解产物的DPPH自由基清除率为79.13%。

响应面法,蒲公英籽,抗氧化肽,酶解工艺

许多人工抗氧化剂如BHT、BHA等都无法避免地带有潜在的毒副作用。通过食源性的蛋白质水解得到的抗氧化肽抗氧化活性高,易吸收,而且无副作用,因此成为研究新型抗氧化剂的热点。通过酶解法利用植物蛋白制备高活性的抗氧化肽已有广泛研究,如用螺旋藻蛋白[1]及玉米蛋白[2]等制备抗氧化肽。

蒲公英为菊科多年草本生植物,是我国家喻户晓的野生蔬菜和中草药。《千金方》、《本草纲目》等中记载蒲公英具有清热解毒、消肿散结、利尿通淋之功效[3]。现代研究表明,蒲公英具有抑菌、抗肿瘤、保肝利胆、促进肠胃动力、提高免疫力、清除自由基延缓衰老的作用[4]。除了药用,蒲公英还可供食用,是一种营养价值极高的野生蔬菜。蒲公英籽作为蒲公英成熟干燥的种子,其营养、活性成分组成与蒲公英全草相似。目前,国内外对蒲公英全草的研究较多,而且主要研究蒲公英黄酮、多糖以及萜类化合物,而对蒲公英籽的蛋白及多肽的研究很少。因此,本文以蒲公英籽为原料,采用蛋白酶酶解法制备抗氧化肽,以DPPH自由基清除活力为考察指标,采用Box-Behnken设计实验,通过响应面法分析各因素对抗氧化肽制备工艺的影响,以优化制备工艺获得最佳工艺条件,为蒲公英籽蛋白的综合利用提供理论参考。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

蒲公英籽福州市种子市场,经中药粉碎机粉碎成粉末后备用;中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶诺特莱斯生物科技有限公司;DPPHSigma公司;其他试剂国产分析纯。

XZ-21K型高速冷冻离心机湘智离心机仪器有限公司;EU2600型紫外-可见分光光度计昂拉仪器有限公司;FE20型pH计梅特勒-托利多仪器上海有限公司;KDN-102C定氮仪纤检仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1蒲公英籽蛋白的酶解工艺碱提酸沉法提取蒲公英籽蛋白,将冷冻干燥后的蒲公英籽粗蛋白粉作为酶解的原料,酶解采用下述工艺进行。

蛋白抽提物→酶解→灭酶→离心→上清液→酶解液

1.2.2水解度的测定甲醛滴定法[5-6]。取水解液5.0 mL于小烧杯中,加入60 mL蒸馏水,磁力搅拌下用0.01 mol/L标准NaOH滴定至酸度计指示pH8.2,加入pH已调至8.2的甲醛溶液20 mL,记录将其pH滴至9.2时所消耗的0.01 mol/L标准NaOH溶液的体积。计算公式:

n=(ΔV×C/W)×(V总/V)

htot=(1×Pro%)/110

DH(%)=(n-n0/htot)×100

式(1)

式中,ΔV-滴定样品与滴定蛋白原液所消耗的标准NaOH溶液体积之差;C-NaOH标准溶液浓度(mol/L);W-原料质量(g);V总-酶解液的总体积(mL);V-滴定取用的酶解液体积(mL);n0-水解前每克蛋白游离的氨基毫摩尔数(mmol/g);n-水解后每克蛋白游离的氨基毫摩尔数(mmol/g);htot-原料蛋白质中所含肽键总数(mmol/g);Pro%-样品的蛋白质含量;110-氨基酸平均分子量。

1.2.3抗氧化活性测定以DPPH自由基清除活力作为指标,考察蒲公英籽酶解物抗氧化能力,参照Chen等人的方法进行测定[7]。

取0.5 mL样品溶液,加入0.5 mL DPPH溶液(浓度为0.1 mmol/L,溶解于95%的乙醇中进行配制),迅速振荡、混匀后避光30 min,在517 nm处测定反应液的吸光值,记作Ai。DPPH自由基清除活性通过下式计算:

式(2)

式中,Ai-样品组(DPPH溶液+样品);Aj-对照组(95%乙醇溶液+样品);A0-空白组(DPPH溶液+去离子水)。

1.2.4单因素实验酶解步骤如1.2.1节,分别对酶的种类(木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶)、底物浓度(0.5%、1%、2%、45、6%、8%)、酶底比(4%、6%、8%、10%、12%、14%)、pH(7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0)和酶解温度(40、45、50、55、60、65 ℃)进行单因素实验,考察各因素对蛋白质酶解工艺的影响。采用甲醛滴定法测定酶解物的水解度,按公式(1)计算。采用DPPH自由基清除活力测定酶解物的抗氧化活性,按公式(2)计算。

1.2.5响应面法优化蒲公英籽抗氧化肽酶解工艺实验在单因素实验结果的基础上,根据Box-Behnken设计原理,采用软件Design Expert V8.0.6建立三因素三水平实验,确定蒲公英籽蛋白酶解最佳工艺条件。以酶解物的DPPH自由基清除率(Y,%)为考察指标,酶解时间(A),酶底比(B)及pH(C)为自变量,因素水平编码见表1。

表1　因素水平编码表Table 1　Code and level of factors chosen

2　结果与讨论

2.1单因素实验

2.1.1蛋白酶种类对酶解物抗氧化活性的影响选择木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶和碱性蛋白酶对蒲公英籽蛋白进行酶解。4种蛋白酶对蒲公英籽蛋白的水解度与酶解物抗氧化活性随酶解时间的变化分别如图1、图2所示。由图1、图2分析可知,碱性蛋白酶的酶解效果最好,胰蛋白酶次之,中性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解效果较差,因此选择碱性蛋白酶为最适作用酶。由碱性蛋白酶的酶解进程曲线分析可知,其水解度在酶解4 h时达到最大后趋于平缓,而其DPPH自由基清除率在酶解4 h以后开始下降,故最适酶解时间选择4 h。

图1　不同蛋白酶水解蒲公英籽蛋白的进程曲线Fig.1　Effect of different proteases on dandelion seeds protein hydrolysis

图2　不同蛋白酶对蒲公英籽酶解物抗氧化活性的影响Fig.2　Effect of different proteases on antioxidant activity of dandelion seeds hydrolysates

2.1.2底物浓度对酶解物抗氧化活性的影响在pH10.0,酶底比8%和酶解温度为45 ℃的条件下酶解4 h,考察不同底物浓度对蒲公英籽蛋白酶解物抗氧化活性和水解度的影响。由图3可知,底物浓度小于2%时,酶解物的DPPH自由基清除率和水解度随底物浓度增加而增大;当底物浓度大于2%时,其清除率和水解度基本不变甚至呈下降趋势,这是因为在底物浓度较低时,增加底物浓度能增大底物与蛋白酶接触的机会,使反应向产物方向进行,但当底物浓度到达饱和点时,体系流动性变差,反而不利于底物与酶的接触[8],因此酶解速率下降,故最适底物浓度为2%。

图3　底物浓度对蒲公英籽酶解物抗氧化活性的影响Fig.3　Effect of substrate concentration on antioxidant activity of dandelion seeds hydrolysates

2.1.3酶底比对酶解物抗氧化活性的影响在底物浓度为2%(w/v),酶解温度为45 ℃和pH10.0条件下酶解4 h,考察不同酶底比对蒲公英籽蛋白酶解物抗氧化活性和水解度的影响。如图4所示,酶解物的DPPH自由基清除率和水解度随酶量的增加而增大,当酶底比为8%时自由基清除率和水解度都达到最大,随后增加酶底比自由基清除率和水解度降低。这可能是因为底物浓度一定时,随着酶量的不断增加,将已生成的具有抗氧化活性的多肽进一步酶解,生成不具有抗氧化活性或者抗氧化活性更小的肽段或氨基酸[9],因此选择最适酶底比为8%。

图4　酶底比对蒲公英籽酶解物抗氧化活性的影响Fig.4　Effect of enzyme/substrate ratio on antioxidant activity of dandelion seeds hydrolysates

2.1.4pH对酶解物抗氧化活性的影响在底物浓度为2%(w/v),酶解温度为45 ℃,酶底比为8%和酶解时间4 h的条件下,考察不同pH对蒲公英籽酶解物抗氧化活性和水解度的影响。结果如图5所示,在pH为8.5时,酶解产物的抗氧化活性和水解度都达到最大,当pH高于或低于8.5时,其抗氧化活性和水解度都呈下降趋势。这是因为酶分子及底物分子的解离状态、酶蛋白构象等受pH的影响,进而影响酶与底物的结合、酶稳定性及产物转化,最终影响酶促催化效果[10-11]。因此选择最适酶解pH为8.5。

图5　pH对蒲公英籽酶解物抗氧化活性的影响Fig.5　Effect of pH on antioxidant activity of dandelionseeds hydrolysates

2.1.5酶解温度对酶解物抗氧化活性的影响在底物浓度为2%(w/v),酶底比为8%和pH8.5的条件下酶解4 h,考察不同温度对酶解物抗氧化活性和水解度的影响。由图6可知,在一定范围内,随着温度的上升,酶解产物的抗氧化活性和水解度都在增加,当温度高于45 ℃时,其抗氧化活性和水解度都在显著下降。这是因为在一定范围内,随温度升高,反应速率增加、酶解物还原能力增强、水解度升高;但温度过高会使酶失活、产物形成方向发生改变,导致水解度的下降[12]。因此最适酶解温度选择45 ℃。

图6　温度对蒲公英籽酶解物抗氧化活性的影响Fig.6　Effect of temperature on antioxidant activity of dandelion seeds hydrolysates

2.2响应面实验设计方案和结果分析

温度、pH和酶底比是影响酶解液活性的主要因素[13],综合单因素实验结果,选用碱性蛋白酶水解蒲公英籽蛋白酶,固定底物浓度为2%(w/v),温度为45 ℃,选酶解时间、酶底比及pH为考察因素,根据响应面分析法Box-Behnken设计原理进行响应面实验。从单因素实验的结果来看,水解度的变化趋势与DPPH自由基清除率的变化趋势基本一致,因此选择DPPH自由基清除率为主要指标。响应面的设计及结果如表2所示。

表3　模型回归方程方差分析Table 3　ANOVA of regression equation

注:p<0.001代表极显著“***”;p<0.01代表较显著“**”;p<0.05代表显著“*”;p>0.05代表不显著。

利用Design-Expert V8.0.6软件进行多元回归拟合,得到回归模型方程:

Y=78.08-0.81X1-1.01X2-1.53X3+1.06X1X2-1.13X1X3-0.92X2X3-11.27X12-9.79X22-11.30X32

2.2.1各因素对蒲公英籽酶解液抗氧化活性的影响分析用各因素的F值可评价该因素对实验指标的影响,F值越大,表明该因素的影响越显著。由表3可知,F(X1)=11.09,F(X2)=17.19,F(X3)=39.82,即各因素对蒲公英籽蛋白抗氧化活性的影响顺序为pH>酶底比>酶解时间。

等高线是响应面中水平方向的投影,等高线的形状表明变量间的交互作用是否显著,椭圆等高线表明变量间的交互作用显著,圆形等高线表明交互作用不显著[14]。由图7至图9可知,酶解时间、pH及酶添加量相互间的等高线都呈明显的椭圆状,表明三因素间具有交互作用。

表2　响应面法实验设计与实验结果Table 2　Respond surface experimental design and results

如果一个响应曲面坡度相对平缓,表明其可以忍受处理条件的变异,而不影响到响应值大小,相反,如果一个响应曲面坡度非常陡峭,表明响应值对于处理条件的改变非常敏感[15]。由图7可知,在时间X1与酶底比X2交互作用的响应面中,沿X2轴方向的响应曲面的坡度明显高于X1,说明酶底比的变化对DPPH自由基清除率的影响相比于时间对其的影响大。从图8和图9中可以看出沿X3轴方向的响应曲面比较陡峭,说明pH的变化对DPPH自由基清除率的影响比时间和酶底比的影响大。

图7　酶底比和酶解时间 对抗氧化肽制备工艺影响的响应面图(pH=8.5)Fig.7　Responsive surfaces of effect of enzyme/substrate ratio and time on preparation of antioxidant peptides(pH=8.5)

图8　酶解时间和pH对抗氧化肽 制备工艺影响的响应面图(酶底比=8.0%)Fig.8　Responsive surfaces of effect of time and pH on preparation of antioxidant peptides(amount of enzyme=8.0%)

图9　酶底比和pH对抗氧化肽 制备工艺影响的响应面图(时间=5.0 h)Fig.9　Responsive surfaces of effect of enzyme/substrate ratio and pH on preparation of antioxidant peptides(time=5.0 h)

综上分析,各变量对酶解蒲公英籽蛋白质制备抗氧化肽工艺的影响主次顺序为:pH>酶底比>酶解时间。

2.2.2最佳提取条件的确定及验证由Design-Expert V8.0.6软件分析得最佳实验条件为:酶解时间4.86 h,pH8.45和酶底比7.76%。鉴于实验的可操作性,将最佳酶解条件调整为:酶解时间4.90 h,pH8.5和酶底比7.80%,其理论DPPH自由基清除率为79.96%。通过多次(n>3)实验后测得最佳条件下蒲公英籽酶解液的DPPH自由基清除率为79.13%,与理论自由基清除率无显著性差异,其相对误差为0.59%,说明通过响应面法优化得到的模型回归方程及最佳条件可靠。

3　结论

利用响应面法建立酶解蒲公英籽蛋白质制备抗氧化肽工艺的二次项数学模型。通过方差分析,该模型显著,所得回归方程拟合度好。影响酶解蒲公英籽蛋白质制备抗氧化肽工艺的各因素主次顺序为pH>酶底比>酶解时间。最佳提取工艺条件是:pH8.5,酶解时间4.90 h和酶底比7.80%。在此条件下,测得蒲公英籽蛋白质酶解物对DPPH自由基的清除率为79.13%,与理论自由基清除率(79.96%)无显著性差异,说明通过响应分析法得到的回归方程能够较好预测实验结果。

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Optimization of enzymolysis technology for preparation of antioxidant peptides from dandelion seeds-derived proteins by response surface methodology

ZHANG Yang,HU Lei,WANG Shao-yun,HONG Jing*

(College of Biological Science and Engineering,Fuzhou University,Fuzhou 350116,China)

The aim of this study was to optimize the hydrolysis technology of preparation of antioxidant peptides from dandelion seeds protein using response surface methodology(RSM). The protein extracted from dandelion seeds was hydrolyzed by alcalase and antioxidant activity of the hydrolysates was evaluated by DPPH radical scavenging activity. Effects of pH,substrate concentration,enzyme/substrate ratio and temperature on DPPH scavenging activity of hydrolysates were evaluated. Based on the results of the single factor experiments,a procedure optimized using the response surface analysis with three factors(pH,enzyme/substrate ratio and hydrolysis time)was conducted in order to obtain the optimal enzymolysis condition. The quadratic term model of the enzymatic preparation technology was established and the reliability was verified. The interaction effects of pH,enzyme/substrate ratio and time were investigated,and the optimal hydrolysis condition was obtained and checked out experimentally. The results indicated that the effect order of the three factors on antioxidant activity of protein hydrolysates was pH>enzyme/substrate ratio>hydrolysis time,and the optimal enzymolysis conditions were time of 4.90 h,pH8.5 and enzyme/substrate ratio of 7.80%. Under the optimal enzymolysis conditions,DPPH radical scavenging rate of the hydrolysates was 79.13%,which indicated that the protein hydrolysates possessed strong antioxidant activity.

response surface methodology;dandelion seed;enzymolysis technology;antioxidant peptides

2015-06-05

张杨(1991-),女,硕士研究生,研究方向:食品生物技术,E-mail:xiah520@163.com。

洪晶(1981-),女,博士，副教授，研究方向:生物化学与分子生物学,E-mail:jhong@fzu.edu.cn。

福建省科技厅资助项目(2013J05050)。

TS201.1

B

1002-0306(2016)05-0258-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.042