运用DNA条形码技术分析市售鱼类及制品的物种真实性

王梦怡,赵庆珠,刘　博,李　想,*,陈舜胜

(1.上海海洋大学,上海 201306;2.上海出入境检验检疫局,上海 200135)



运用DNA条形码技术分析市售鱼类及制品的物种真实性

王梦怡1,2,赵庆珠2,刘博2,李想2,*,陈舜胜1

(1.上海海洋大学,上海 201306;2.上海出入境检验检疫局,上海 200135)

目的:运用准确快速的鱼类品种鉴定方法,对上海市售鱼类制品标识符合性进行调查。方法:利用DNA条形码技术,以动物线粒体细胞色素C氧化酶(Cytochrome C Oxidase Subunit I,COI)基因序列为鉴定靶标,对采集的63种市售鱼类样本进行序列分析比对后,分析样品的标注名称与真实物种名的一致性。结果:经序列测定和比对,13份样品的鱼类品种名称与标注名称不一致,占20.63%,此外有19份样品标注名为一类鱼的总称或俗称,占30.16%。结论:目前,我国对鱼类及其制品物种真实性鉴定研究亟待发展,鱼类标注物种名称混乱,分类不清,概念模糊,急需规范化。

DNA条形码技术,鱼类及其制品,品种鉴定,COI基因,掺假鉴别

鱼类是人们餐桌上必不可少的美味佳肴之一,也是全球贸易的重要组成部分。由于鱼类品种多样,营养价值和经济价值千差万别,为了追求利益的最大化,鱼类制品以次充好、假冒替代现象十分严重。目前,世界水产制品种属错误标签问题时有报道,尤以鱼类更为严重。据不完全统计,爱尔兰和西班牙鳕鱼类产品错误标签率均超过20%、南非鱼类产品错误标签率31%、美国红鲷鱼错误标签率为77%[1-5]。在我国,问题同样严重。如全国多家超市因被怀疑用“油鱼”充当“鳕鱼”,而遭消费者投诉[2-4]。由于鱼类制品从外观上很难鉴定种属类别,因此基于分子生物学技术对鱼类制品进行物种真实性鉴定十分必要。

近年分子生物技术发展迅速,很多分子鉴定方法已用于鱼类的鉴定。如RAPD[5-8]、RLFP技术等[9-13],但这些方法费时费力,且结果稳定性差。也有国内外研究者利用特异性基因鉴定鲨鱼、鲣鱼、鲑鱼[14-18],但这些研究仅限于鉴定一种或一类鱼。

表1　用于物种鉴定的样品信息

近年发展起来的DNA条形码技术,是基于某段特异性DNA片段的序列分析实现物种鉴定的方法。在动物物种鉴定中,采用线粒体细胞色素C氧化酶亚基I基因(COI)上的一段650 bp序列作为鉴定靶标逐渐得到各国科学家的认同。DNA条形码法具有能快速、准确、客观鉴定物种等优点[19],已被美国FDA确定作为鱼类物种鉴定的方法[20]。目前已有报道COI基因用于鲤科、石斑鱼、三文鱼、蟹类等的鉴定[21-25]。基于此,本研究对现有COI基因检测体系进行比较和优化,并对市售63份样品进行种属鉴定,对其标注名称与真实物种名称进行比对分析,以期获得上海市场上鱼类制品标注真实情况的初步结果。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

63份样品信息详见表1,购自超市、水产市场或进口商;海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(Cat.# DP324-02)购自天根生化科技(北京)有限公司;2×Premix Ex Taq HS(Cat. # FRRR030A)购自宝生物工程(大连)有限公司;10×PCR缓冲液(Cat. # 10966-034)、MgCl2(Cat. # 10966-034)、1 U Platinum Taq DNA聚合酶(Cat. # 10966-034)和dNTPs(Cat. # 18427-013)购自美国Invitrogen公司;琼脂糖(Cat. # RT101)和50×TAE缓冲液(Cat. # RT204)购自天根生化科技(北京)有限公司;引物宝生物(大连)有限公司;实验所用其它试剂均为分析纯或优级纯;实验用水灭菌超纯水。

6850型冷冻研磨机美国Spex公司;NanoVue Plus微量分光光度计美国GE公司;2S-2200型凝胶成像系统美国Alpha公司;Mastercycler pro PCR扩增仪德国Eppendorf公司;CL-32L型全自动高压灭菌锅日本ALP公司。

1.2基因组DNA提取

表2　PCR所用的引物序列

注:*灰色部分为M13引物序列,用于测序。

用无菌手术刀去除表层鱼肉,以防止加工过程中的交叉污染。切取内部鱼肉10 g左右,切成小块,置冷冻研磨机中研磨成均匀地泥状,称取研磨后的样品100 mg,采用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA,每次提取均设空白对照。利用微量分光光度计测定DNA样品的浓度和纯度,并稀释至10 ng/μL,置-20 ℃保存备用。

1.3引物

经对多对引物进行比对,确定选用优化后的下述COI基因引物进行扩增:上游引物和下游引物分别由四条引物按照1∶1∶1∶3的比例混合而成(表2)[26]。同时采用18S rRNA引物[27]对所有DNA样品进行PCR扩增,以测试提取的DNA是否可用于进一步序列分析。

1.4PCR扩增反应条件

1.4.118S rRNA PCR扩增PCR反应条件:94 ℃,10 min;36个循环×(94 ℃变性20 s;56 ℃退火30 s;72 ℃延伸30 s);72 ℃延伸10 min[31]。

1.4.2COI基因PCR扩增PCR反应体系为25 μL,包含2.5 μL 10×PCR缓冲液,2 mmol/L MgCl2,400 nmol/L上游或下游引物,200 nmol/L dNTPs,1 U Platinum Taq DNA聚合酶,2 μL模板DNA,不足用ddH2O补齐。

PCR反应条件:94 ℃预变性1 min;5个循环×(94 ℃变性30 s,50 ℃退火40 s,72 ℃延伸1 min);35个循环×(94 ℃变性30 s,54 ℃退火40 s,72 ℃延伸1 min);72 ℃延伸10 min。

PCR产物检测方法:取5 μL PCR产物,在2.0%琼脂糖凝胶和0.2% TAE缓冲液中电泳30 min(120 V),然后采用凝胶成像系统拍照存档。

1.5PCR产物序列比对和数据分析

将所有成功扩增出COI基因序列的扩增产物送上海美吉生物医药科技有限公司,采用M13正反向引物双向测序并拼接结果,利用MEGA5.2软件[28]人工修正测序结果。

测序结果通过Genbank(http://www.Genbank. nlm.nih.gov)和BOLD(www.barcodinglife.org)数据库比对分析,确定鱼类的种属名(相似度需达到≥98%[29])。

2　结果与分析

2.1PCR结果

2.1.118S rRNA PCR结果当使用18S rRNA引物扩增时,63份鱼样均可见明亮的目的条带(数据未在此呈现),表明提取的DNA可用于进一步PCR扩增。

2.1.2COI基因PCR扩增结果对PCR产物进行电泳分析,发现除DNA提取空白和加样空白对照外,所有样品DNA均在650 bp左右有单一的目的条带,表明COI基因引物适合鱼类PCR扩增,可用于进一步序列分析。图1为部分样品扩增后电泳图。

图1　部分PCR产物电泳图Fig.1　Partial PCR results of commercial samples注:泳道S1～S45,分别为S1～S45号样品的扩增;泳道N为加样空白;泳道B为提取空白。

2.2COI基因序列比对结果

为了能够更加准确的对样品种属进行鉴定,所有样品DNA序列均在Genbank和BOLD数据库中进行序列比对,结果如表3所示。大部分样品在Genbank和BOLD数据库中都能准确鉴定出样品种名(最大相似度≥98%)。S23、S26、S27及S60四个样品DNA序列在Genbank数据库中不能准确鉴定出种名,最大相似度分别为85%、90%、92%及87%,除S60外,另外3个鱼样在BOLD数据库可准确鉴定出种名,最大相似度均大于99%。

表3　样品测序结果比对

续表

续表

注:G表示与Genbank数据库比对结果;B表示与BOLD数据库比对结果;*1 表示标注名称与真实种名完全不符;*2表示标注名称是真实种名的同科其它种属;*3表示标注名称为一类鱼的总称。

有些样品在两个数据库中鉴定的种属名称不一致。S26样品在Genbank数据库中的比对结果为黄鳍短须石首鱼(Umbrinaroncador),相似度为90%,在BOLD数据库中的比对结果为阿根廷短须石首鱼(U.canosai),相似度为99.69%。相比之下,BOLD数据库中的序列相似度更高,说明有些序列信息只上传至其中的一个数据库中,因此在对鱼类品种进行分析时尽量选择两个数据库进行比对以提高鉴定的准确性。S60海鳗(Muraenesoxcinereus)在Genbank数据库比对最大相似度为87%,在BOLD数据库中不能比对到近似的序列,可能由于该鱼种来源于我国,而我国还未进行过相关研究,因此没有COI基因的序列信息。

有些样品在Genbank及BOLD数据库中可比对到多个种名。S39在Genbank数据库中比对结果为无鳔鲉属的赫氏无鳔鲉(Helicolenushilgendorfi)和胎生无鳔鲉(H.avius),相似度均为99%;在BOLD数据库的比对结果为无鳔鲉属的转化型(Helicolenus.sp),相似度为99.84%。S44和S57在Genbank及BOLD数据库比对均得到两个品种,S44在Genbank数据库中比对结果为马面鲀属的拟短角单棘鲀(Thamnaconusmodestoides)和短角单棘鲀(T.modestus),相似度均为99%,在BOLD数据库的比对结果相同,相似度均为100%;S57在Genbank数据库中比对结果为石斑鱼属的清水石斑(Epinepheluspolyphekadion)和褐点石斑(E.fuscoguttatus),相似度均为99%,在BOLD数据库的比对结果相同,相似度均为99.84%。说明有些鱼类品种亲缘性很高,进化关系近,序列差异小。也可能在分类上,某些品种的分类还不甚明晰或存在分歧。

2.3样品标签名称的真实性分析

在检测的63份样品中,30份样品的鱼类品种名称与标注名称完全一致,占总样品的47.62%;13份样品的鱼类品种名称与标注名称不一致,其中5份样品的标注名称与真实种名完全不符,占总样品的7.94%;其余8份样品标注为同科其它种属,占总样品的12.70%;另外,有19份样品标注的为一类鱼的总称或俗名,而非品种名称,占总样品的30.16%(图2)。

图2　样品标注名称真实性分析结果Fig.2　Analysis results of authority of sample name

标注名称与真实种名完全不符的样品有5份,编号分别为S5、S13、S15、S26、S28,错误标签率为7.94%。S5标注名称为银鳕鱼(Anoplopomafimbria),隶属于鮋形目裸盖鱼科裸盖鱼属,鉴定的种名为小鳞南极犬牙鱼(Dissostichuseleginoides),隶属于鲈形目南极鱼科犬牙南极鱼属。这两种鱼隶属于两个不同的目,但由于银鳕鱼价格昂贵,常被一些不法商贩用其它鱼种假冒替换,其中以小鳞南极犬牙鱼较为常见。此外,消费者也常将银鳕鱼与鳕鱼混淆,鳕鱼是鳕形目(Gadiformes)鱼类的总称,其价格要低于银鳕鱼。S13标注名称为蓝鳕(Micromesistiuspoutassou),隶属于鳕形目鳕科蓝鳕属,鉴定的种名为新西兰拟鲈(Paraperciscolias),隶属于鲈形目拟鲈科拟鲈属;S15标注名称为黑鳕(Melanonusspp.),隶属于鳕形目黑鳕科黑鳕属,鉴定的种名为裸盖鱼(Anoplopomafimbria),隶属于鮋形目裸盖鱼科裸盖鱼属;S26标注名称为黄鳍棘鲷(Acanthopagruslatus),隶属于鲈形目鲷科棘鲷属,鉴定的种名为阿根廷短须石首鱼(Umbrinacanosai),隶属于鲈形目石首鱼科短须石首鱼属;S28标注名称为真鲷(Pagrosomusmajor),隶属于鲈形目鲷科赤鲷属,鉴定的种名为黑鳍髭鲷(Hapalogenysnigripinnis),隶属于鲈形目石鲈科髭鲷属。这类不一致情况一般为商家故意假冒替换,由于实际种名鱼类较昂贵,商家为了追求经济利益,常用一些肉质相似且价格较低的鱼类冒充替换。

此外,有19份样品标注的为一类鱼的总称或俗称,而非品种名称,分别为S1、S3、S4、S7、S8、S11、S12、S16、S31、S33、S36、S38、S41、S44、S52、S56、S57、S58、S59,占30.16%。其中以目为命名的有4种,分别为S12、S16、S41、S59,比如S12和S41,标注名称分别为比目鱼、左口鱼,其名称均为鲽形目鱼类的统称,经鉴定分别为格陵兰大比目鱼Reinhardtiushippoglossoides、牙鲆Paralichthysolivaceus。以科命名的有6种,分别为S1、S3、S4、S31、S33、S58,比如S1、S3和S4标注名称分别为三文鱼刺身、冻鲑鱼、冻鳟鱼,其商品名为三文鱼,均为鲑科鱼类,但这三种鲑鱼的价格却相差甚远,其中大西洋鲑Salmosalar的价格要高于虹鳟Oncorhynchusmykiss和大麻哈鱼O.keta。S31、S33、S58标注的名称分别为鲈鱼(鲈总科)、石鲈(石鲈科)和带鱼(带鱼科),经鉴定分别为大口黑鲈Micropterussalmoides、三线矶鲈Parapristipomatrilineatus、白带鱼Trichiurusaponicas。以属命名的有9种,分别为S7、S8、S11、S36、S38、S44、S52、S56、S57,比如S7、S8均标注名称为金枪鱼(金枪鱼属),但不同品种金枪鱼价格不同,蓝旗金枪鱼价格要高于黄鳍金枪鱼;S11标注为黄盖鲽(黄盖鲽属)。出现这一情况的主要原因是由于全球鱼类商业化进程中俗名更适于使用和记忆,也有些鱼类名称是外来语的音译,沿用至今。随着鱼类制品全球化发展,越来越需要鱼类名称的规范化,以促进渔业贸易公平,促进国际贸易的正常有序进行。

3　结论

本研究利用DNA条形码技术初步分析了市售鱼类制品的品种真实性标识情况。在抽检的63份样品中,13份样品的鱼类品种名称与标注名称不一致,其中5份样品标注名称与实际品种名称有较大差异,分属不同科,占样本总数的7.94%;8份样品标注为同科的其它品种,占12.70%。此外,在13份标注名称与实际种名不一致的样品中,除S26、S48外均为进口鱼类,进口鱼类的错误标识占总错误标识的84.62%,其主要原因可能是进口鱼类在从捕捞到消费者期间,环节较多,易出现假冒替代。另外,有19份样品标注名称为一类鱼的总称或俗称,而非品种名称,占30.16%。相比之下,仅有47.62%的样品标注名称与实际名称完全一致。因此,从本次调查结果看,无论是进口还是国产鱼类,上海市场鱼类制品错误标识现象广泛存在。鱼类制品的“名不副实”不仅侵害了消费者的经济利益,而且鱼制品中的某些成分易造成食品安全风险;同时其对渔业公平贸易和国际水产品贸易的有序化和规范化也造成极大影响。因此,从技术和法律规范上,我国均应进一步出台措施,以促进进出口鱼类制品标识的规范化。

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Species authority of fish and its derived products in Shanghai by DNA barcoding

WANG Meng-yi1,2,ZHAO Qing-zhu2,LIU Bo2,LI Xiang2,*,CHEN Shun-sheng1

(1.Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China; 2.Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Shanghai 200135,China)

Objective:To investigate the authority of labeling of fish and its derived products in Shanghai,DNA barcoding was applied to identify fish species. Methods:Based on an animal mitochondrial cytochrome c oxidase I(COI)gene,63 fish DNA samples were sequenced and aligned to analyze the consistency of labeling name and the true species name. Results:After sequencing and alignment,the true name of 13 fish samples out of 63 was different with the labeling name with the percentage of 20.63%. In addition,19 samples labeled the popular name or the name of a class of fish,with the ratio of 30.16%. Conclusion:At present,the research on species authority identification of fish and its derived products is urgent to develop. The labeled fish species name is disordered and unclear in classification in our country. The fish species authority needs to be normative and regular.

DNA barcoding;fish and its derived products;species identification;COIgene;authority identification

2015-09-29

王梦怡(1988-)，女，硕士研究生，研究方向：食品科学与工程，E-mail:113744526@qq.com。

李想(1978-)，女，高级工程师，研究方向：分子生物学，E-mail:idealne@163.com。

上海市技术标准专项项目(14DZ0501002)；上海检验检疫局科技计划项目(HK012-2014)。

TS254.7

A

1002-0306(2016)10-0049-09

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.001