基于纳米金与牛血清白蛋白-碳纳米管复合物修饰的microRNA电化学传感器的研究

苏会岚（成都医学院公共卫生系，四川成都610500）

基于纳米金与牛血清白蛋白-碳纳米管复合物修饰的microRNA电化学传感器的研究

苏会岚*
（成都医学院公共卫生系，四川成都610500）

该文采用纳米金和牛血清白蛋白（BSA）-碳纳米管固载核酸探针制得高灵敏microRNA电化学传感器。首先，使碳纳米管在质量分数为0.25%的BSA中分散，并将其滴涂在玻碳电极上成膜，将识别探针ssRNA固载到电极表面，制得microRNA电化学传感器。采用循环伏安法对电极的制备过程及响应特性进行了研究，实验结果表明该修饰电极对microRNA电化学响应的浓度线性范围为0.1～150 nmol/L，检出限为0.03 nmol/L。该方法具有较高灵敏度、良好的选择性和稳定性，可实现对microRNA的定量分析。

碳纳米管；纳米金；电化学传感器；microRNA

0　引言

MicroRNAs（miRNA，miR）是一类内源性非编码单链RNA，通常为19～25个核苷酸，在细胞的分化、增殖、肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用，是当前生命科学领域的研究热点和前沿之一［1-2］。研究表明，miRNA的异常表达与肿瘤的发生发展密切相关，可作为肿瘤诊断和预后判断的疾病标志物［3-5］。目前，用于检测血清miRNA的方法主要有qRT-PCR、微阵列芯片技术等［6-7］。然而，这些方法存在成本高、步骤繁琐、易污染等缺点。而电化学生物传感器是将生物识别作用与电化学分析技术结合在一起的新型生物分析技术，具有灵敏度高、检测速度快、成本低、准确度高等优点，可望用于miRNA的临床检测。

生物识别分子的固定化是生物传感器制备过程中的关键技术之一，能否保证生物分子的识别活性关系到检测结果的准确程度。生物分子的固定化材料主要有纳米材料、有机高分子材料及其它生物材料。其中，基于碳纳米管的复合纳米材料具有比表面积大，导电性能佳的特点，通过在电极表面的有效固载可有效增大电极比表面积，提高电极表面的电子传输效率［8-10］。基于此，该研究通过在电极表面自组装牛血清白蛋白和碳纳米管的复合物，再通过电沉积法修饰一层纳米金，进一步固载识别ssRNA，通过碱基互补配对作用实现对目标miRNA的检测。该方法灵敏度高、操作简单、检测快速，可望应用于临床核酸检测中。

1　实验部分

1.1仪器与试剂

CHI660电化学工作站 （上海辰华仪器公司），BRANSONIC200超声清洗仪（德国），MP230酸度计（瑞士Mettler-toledo公司），AB204-S电子天平（瑞士Mettler-toledo公司），所有玻璃仪器用k2Cr2O7-H2SO4浸泡，超声清洗仪超声，晾干。

miR-21（5'-CAA CAC CAG UCG AUG GGC UGU-3'）、ssRNA（5'-SH-ACA GCC CAU CGA CUG GUG UUG-3'）购于大连宝生物。巯基己烷（HT，96%）、氯金酸、牛血清白蛋白（BSA）购于sigma公司，碳纳米管（MWNTs）购于深圳纳米港科技有限公司。实验室用水均为二次去离子水。

1.2miRNA电化学传感器的制备

1.2.1BSA-碳纳米管复合物的制备

MWNT使用前，用浓硝酸∶浓硫酸（3∶1）80℃处理5 h，水洗后真空干燥。在3.5 mL质量分数为0.25%的BSA中加入5 mg碳纳米管，超声2 h，既得BSA-MWNTs复合物。

1.2.2miRNA电化学传感器的制备

将玻碳电极（GCE）在1.0，0.3 μm的Al2O3糊中将电极表面抛光成镜面，用蒸馏水和无水乙醇交替超声5次，室温晾干。将10 μL所制得的BSA-MWNTs复合物滴涂于预处理好的电极表面，自然晾干后利用电化学还原HAuCl4的方法在GCE表面沉积上一层纳米金，之后将10 μL ssRNA滴涂在修饰电极表面。4°C下放置6 h。最后用HT封闭电极上非特异性吸附位点，即制得miRNA电化学传感器。将电极置于4°C的冰箱中保存待用。

1.3检测方法

利用循环伏安法（CV）对电极的制备过程进行电极制备过程的表征，参比电极为饱和甘汞电极，Pt电极为对电极，修饰的玻碳电极为工作电极，电极表征在5 mmol/L K3Fe（CN）6+K4Fe（CN）6+0.1 mol/L KCl+0.1 mol/L PBS（pH=7）溶液中进行，循环伏安法电位区间为-0.2～0.6 V，扫描速率为50 mV/s。

2　结果与讨论

图1　电极修饰过程的循环伏安表征：（a）GCE；（b）GCE/MWNTs-BSA；（c）GCE/MWNTs-BSA/DpAu；（d）GCE/MWNTs-BSA/DpAu/ssRNA；（e）GCE/MWNTs-BSA/DpAu/ssRNA/HT；（f）识别miR-21Fig.1　Cyclic voltammograms of different electrodes：（a）GCE；（b）GCE/MWNTs-BSA；（c）GCE/MWNTs-BSA/ DpAu；（d）GCE/MWNTs-BSA/DpAu/ssRNA；（e）GCE/ MWNTs-BSA/DpAu/ssRNA/HT；（f）linked miR-21

2.1电极在修饰过程中的电化学表征

用循环伏安法研究电极在组装过程中的电化学特性，其结果示于图1。曲线a是裸电极在铁氰化钾溶液中的循环伏安表征图，图示一对准可逆的氧化还原峰；将BSA-MWNTs纳米复合膜滴涂于玻碳电极表面后，由于惰性蛋白BSA阻碍电子传递，导致峰电流有所降低（曲线b）；利用电化学还原HAuCl4的方法在修饰电极表面沉积一层纳米金，由于DpAu-MWNTs纳米复合膜的形成，增大比表面积的同时峰电流显著升高（曲线c）；曲线d是ssRNA固定在电极表面之后的循环伏安图，由于核酸分子阻碍电子传输，峰电流有所降低；之后用HT封闭非特异性吸附位点，峰电流继续降低（曲线e）；最后将修饰好的电极用于结合目标miRNA，生成的核酸复合物部分堵塞修饰电极表面的电子传输通道，致使其响应电流进一步下降（曲线f）。

图2　修饰电极在不同扫速下的循环伏安图，插图为峰电流与扫速的关系曲线Fig.2　Cyclic voltammograms of the modified electrode in the 0.1 mol/L phosphate butter solution at scan rate of （from inner to outer）：10，30，50，80，100，120，140，160，180，200，300 and 350 mV/s；Inset：plot of peak current vs scan rate

图3　修饰电极在不同pH值下的循环伏安图Fig.3　Cyclic voltammograms of the modified electrode in detection solution with different pH

图4　温度对传感器的影响Fig.4　The effect of incubation temperature on the response of the biosensor

2.2扫描速度对传感器响应的影响

对不同扫描速度下电化学传感器的循环伏安曲线进行了表征。由图2可见准可逆的氧化还原曲线，随着扫速的变化，氧化峰电流和还原峰电流值都随之增加，并且和扫速平方根成正比（插图），说明电极氧化还原受扩散过程控制。

2.3实验条件的优化

2.3.1pH对修饰电极的影响

pH对生物分子的活性有较大影响。在pH从4.0～7.5范围内的PBS中，用循环伏安法测试不同pH下修饰电极的循环伏安曲线 （如图3），其中当pH为7.0时，氧化还原峰电流均达到最大值。故该文选择pH7.0的PBS作为测试底液。

2.3.2温度的选择

温度是影响生物识别反应的一个重要因素，该实验在5～40℃范围内考察了温度与反应信号的关系。结果表明随着温度从5～40℃升高，响应电流减小，说明生物识别反应的程度逐渐增加。由图4可知水浴温度为35℃时核酸结合已经比较稳定。当温度升高时，反应速率增加，但温度过高也会引起核酸分子变性，减少使用寿命，温度太低会使生物识别作用不够或作用时间延长，不利于电极的稳定性。因此综合考虑选择水浴温度为35℃。

2.3.3孵育时间的选择

碱基互补配对反应完成的程度与反应时间有关，将修饰有核酸分子的电极放入1 nmol/L miR-21溶液中，反应不同时间，用循环伏安法测定其响应电流的变化，其结果示于图5。实验发现，反应30 min时，电极上结合的miR-21达到饱和，响应电流逐渐稳定。故实验过程中选择的最佳反应时间为30 min。

图5　孵育时间对传感器的影响Fig.5　The effect of incubation time on the response of the biosensor

2.4miRNA电化学传感器的响应特性

在最优的实验条件下，用循环伏安法测定了修饰电极对不同浓度miRNA的响应特性。当溶液中的抗原和电极表面的抗体专一性结合后，生成的抗原-抗体复合物堵塞了修饰电极表面的电子传输通道，从而致使其响应电流下降。CEA抗原的浓度越高，敏感膜上生成的抗原-抗体复合膜就越多，响应电流下降就越明显。如图6所示。

图7为该电极的响应曲线。miR-21浓度在0.1～150 nmol/L的范围内该传感器与峰电流的对数值呈良好的线性关系。其线性回归方程为：y= -12.58x+137.41，相关系数 0.9951，检测限为0.03 nmol/L。

2.5miR-21传感器的选择性、重现性、稳定性

选择性研究：在1 nmol/L的miR-21中分别加入了甲胎蛋白、癌胚抗原、牛血清白蛋白、葡萄糖、miR-155，响应电流的变化分别为 2.1%，1.9%，3.4%，2.8%，5.1%，表明该传感器具有良好选择性。

重现性研究：同时制备6支电极用于测定1 nmol/L的miR-21，响应结果显示，电流变化值的标准偏差为4.3%（n=6），表明该传感器重现性较好。

稳定性研究：将传感器置于测试底液中连续扫描100圈后，其氧化峰电流变化值小于5%，说明该传感器具有良好的稳定性。

图6　修饰电极在不同浓度CEA下的循环伏安图，从里到外浓度分别为0.1，0.2，0.6，1，5，10，20，40，80，100，120以及150 nmol/LFig.6　Cyclic voltammograms of the modified electrode in concentration of CEA of 0.1，0.2，0.6，1，5，10，20，40，80，100，120 and 150 nmol/L from inner to outer，at scan rate 50 mV/s

图7　电流响应值与miR-21浓度的关系曲线Fig.7　Linear relationship between the peak current and Cyclic voltammograms of the biosenor in different concentration of miR-21

3　结论

该文研究了一种快速，简单，灵敏的电化学传感器。通过电化学方法沉积纳米金可有效固载核酸分子，并结合导电性能好、比表面积大的MWNTs-BSA复合物，成功构建了高灵敏的miRNA电化学传感器。该传感器具有较低的灵敏度和较宽的线性范围、步骤简单、稳定性和选择性良好，可望用于miRNA的检测中。

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An electrochemical biosensor for microRNA detection based on gold nanoparticles and multi-wall carbon nanotube-BSA composite

Su Hui-lan*
（The department of public health，Chengdu medical college，Chengdu，610500，China）

A highly sensitive amperometric biosensor for the determination of microRNA was developed based on the multilayer，comprised of bovine serum albumin（BSA），multi-wall carbon nanotubes（MWNTs），gold nanoparticles（nano-Au）.First of all，to obtain functional MWNTs by BSA（BSA-MWNTs），the MWNTs were dispersed inω（BSA）=0.25%.After that，based on electrochemical deposition of Au3+onto nano-Au/BSA-MWNTs surface，a functionalized multilayer（DpAu/BSA-MWNTs）modified electrode was fabricated.At last，the immunosensor was prepared after the ssRNA absorbed to the surface of the modified electrode.The stepwise fabrication process of the biosensor was characterized by the cyclic voltammetrys.The results show that the immunosensor present highly sensitivity，and a broader liner response from 0.1～150 nmol/L with a detection limit of 0.03 nmol/L，as well as good stability and selectivity.

MWNTs；nano-Au；immunosensor；microRNA

四川省教育厅科研项目（13ZB0228），成都医学院科技基金项目（CYZ12-004），国家自然科学基金（81401757）

*通信联系人，Tel:（028）62739576，E-mail:suhuilan1986@163.com