超高液相色谱串联质谱法测定小麦粉中真菌毒素

刘利亚，李磊，周贻兵，王娅芳（贵州省疾病预防控制中心卫生监测检验所，贵州贵阳550004）

超高液相色谱串联质谱法测定小麦粉中真菌毒素

刘利亚，李磊，周贻兵，王娅芳*
（贵州省疾病预防控制中心卫生监测检验所，贵州贵阳550004）

建立小麦粉中雪腐镰刀菌烯醇（NIV）、隐蔽型脱氧雪腐镰刀烯醇（Deepoxy-DON）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）及衍生物（3A-DON、15A-DON）、玉米赤霉烯酮（ZEN）常见6种真菌毒素的同时测定方法。试样用多功能净化柱净化，液相色谱-串联质谱基质内标法定量测定。结果表明6种真菌毒素的检出限在0.50 μg/kg～1.00 μg/kg之间，线性相关系数R2＞0.994，3个水平加标回收率为82.1%～108.9%，RSD为4.6%～14.5%。采用本方法参加面粉中脱氧雪腐镰刀烯醇能力验证样品质控考核，统计结果Z为-1.93，结果评价为满意。该方法准确、灵敏、高效，可适用于小麦粉中6种常见真菌毒素的定量分析。

液相色谱-串联质谱；多功能净化；内标法；真菌毒素；小麦粉

method；mycotoxins；wheatflour

真菌毒素也称霉菌毒素，是霉菌等真菌在其所污染的农作物或食品原料中产生的有毒的次生代谢产物，目前发现约300多种有毒的真菌次生代谢产物，其中以黄曲霉毒素类（AFs）、伏马毒素类（FBs）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇以及玉米赤霉烯酮毒素对经济及人们的健康危害尤为巨大［1］。超过一定摄入量后会损坏人的肝肾功能、致癌、致畸并诱发免疫抑制性疾病［2］。我国作为粮食生产大国，是受真菌毒素污染比较严重的国家之一［3］，据研究调查表明，我国小麦主要为镰刀菌毒素真菌污染，包括脱氧雪腐镰刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮等，其DON检出率在55%～100%，ZEN的阳性检出率达到5.9%～100%，ZEN的超标率可以达到38.6%，平均值接近限量标准的3倍［4］，目前，我国的粮食卫生标准［5］规定小麦中的DON限量为1 000 μg/kg，ZEN限量为60 μg/kg。小麦粉为面食生产的主要原料，尤其我

目前食品中真菌毒素的检测方法主要有薄层色谱法（TIC）、酶联免疫吸附法、气相色谱法、免疫亲和柱净化高效液相色谱法［6-9］，上述方法大多均只能检测单一组分或同一类的真菌毒素。近年来，液相色谱串联质谱法由于其较好的分离度和较高的灵敏度逐渐成为同时检测多种真菌毒素的主要手段［10-12］。本实验室采用多功能柱净化、内标法定量，结合液相色谱-串联质谱技术建立了小麦粉中多种真菌毒素的定量测定方法。大大提高检测的灵敏度和特异性，比传统前处理方法更为简便，并且可同时检测多种毒素。经能力验证质控考核确认准确可靠，采用建立的方法对国家食品安全风险监测工作中小麦粉类食品进行了检测定量，为提高国家食品安全风险监测数据质量和工作效率提供了有效的技术支撑。

1　试验部分

1．1仪器、试剂与材料

TSQ Quantum ultra三重四极杆质谱仪，配电喷雾离子源（ESI），Ultimate3000超高压液相色谱仪：美国ThermoFisher科技有限公司；3-18K台式高速离心机：德国Sigma公司；TTL－DCⅡ型氮吹仪：北京同泰联科技发展有限公司；艾科浦超纯水机：重庆颐洋企业发展有限公司。

玉米赤霉烯酮（ZEN）、雪腐镰刀菌烯醇（NIV）、隐蔽型脱氧雪腐镰刀烯醇（Deepoxy-DON）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇（3-DON）、15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇（15-DON）标准品：均购自美国Sigma公司；U-［13C15］-脱氧雪腐镰刀菌烯醇（U-［13C15］-DON）同位素内标：均购自Romer公司。

多功能净化柱MycosepTM112、MycosepTM226、MycosepTM228：ROMER公司；乙腈、甲醇（色谱纯）：美国Merk公司；无水硫酸镁（使用前在450℃烘烤2 h，冷却后备用）、氯化钠、冰乙酸、乙酸铵（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；甲酸（纯度≥98.0%）：德国CNW公司；样品：购自贵州全省各市（州）、县（区）超市和农贸市场。

1.2样品提取

称取2 g试样（精确至0.01 g）于50 mL具塞离心管中；加入含U-［13C15］-DON 500 μg/L内标混合储备液200 μL，加1%（体积比）乙酸的乙腈/水（85∶15，体积比）提取液20 mL，超声提取10 min后加入2 g无水硫酸镁和1 g氯化钠；涡旋振荡2 min，以10 000 r/min离心5 min，取上层溶液于MycosepTM228净化柱玻璃管，将净化柱填料管插入玻璃管并缓慢推进，取5 mL续滤液于氮吹管中50℃下氮吹至干，加入甲醇-10 mmol/L乙酸铵（1∶1，体积比）1 mL溶解，混匀后过0.22 μm微孔滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定。

按照上述方法测试后的样品，如果未检测到6种真菌毒素将作为空白样品用于回收率试验和制备基质校正溶液。在进行加标试验时，取适量稀释后的标准溶液加入到空白样品中，充分混合静置过夜后按样品处理。

1.3标准溶液的配制

标准储备溶液的配制：将ZEN、NIV、Deepoxy-DON、DON、3-DON、15-DON分别用甲醇稀释成浓度为10 μg/mL的标准储备液，－18℃下避光保存备用。

基质混合标准工作溶液：用空白样品提取液将标准储备溶液以甲醇-10 mmol/L乙酸铵（1∶1，体积比）稀释成标准系列使用液，使标准使用液中内标物浓度为U-［13C15］-DON 25 μg/L，基质混合标准工作溶液应现配现用。

1.4仪器条件

液相条件：色谱柱为Thermo Hypersll GOLD C18 （100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；柱温30℃；进样体积为10 μL；流速为0.3 mL/min；流动相A为0.1%氨水，流动相B为甲醇；梯度洗脱条件见表1。

表1　 梯度洗脱条件Table 1　Gradient elution conditions

质谱条件：电喷雾负离子检测模式；喷雾电压3 000 V；雾化器温度300℃；离子传输管温度270℃；鞘气压力：276 kPa，辅助气压力：104 kPa，碰撞气（Ar）压力：0.2 Pa；监测离子对、碰撞能量和透镜电压等参数见表2。

2　结果

2.1检测条件优化

2.1.1色谱柱选择

分别考察Waters Acquity BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、Agilent Proshell 120 EC-C18（50 mm× 2.1 mm，2.7 μm）以及 Thermo Hypersll GOLD C18 （100 mm×2.1 mm，1.9 μm）等C18反向色谱柱，结果表明，常见小粒径填料C18高压色谱柱均能满足该分析测试要求，根据不同色谱分离要求结合监测设备自身特点，本次检测试验选择Thermo Hypersll GOLD C18色谱柱。

表2　 定性定量离子参数Table 2　Qualitative and quantitative ion parameters

2.1.2流动相选择

液质联用技术检测多组分目标化合物时，流动相的选择除考虑色谱柱能将目标化合物有效分离外，还应关注待测组分进入质谱后各离子化效率，实际测试中，液相的分离和质谱的离子化效果是一对矛盾体［12］，本次流动相优化重点考察甲醇-水和乙腈-水两种洗脱体系，试验发现，在负离子监测模式下，单纯以纯水为弱洗脱流动相，无论强洗脱流动相是甲醇或乙腈，离子化效率均较差，当弱洗脱流动相纯水中加入适量的氨水后，离子化效率均有较明显的提高，考虑色谱柱和质谱耐受性，同时满足样品分离效果和灵敏度，最终选择0.1%氨水和甲醇为流动相。

2.1.3提取方法选择

根据各待测组分理化性质，真菌毒素易溶于甲醇和乙腈，故本试验提取溶剂重点考察甲醇和乙腈。因乙腈沸点较高，在实际样品小麦粉提取后需浓缩、转相和定容等后续处理，氮吹时甲醇较乙腈方便，最终选择用甲醇做提取溶剂，考虑实际样品小麦粉的溶解性需加入一定比例纯水。经试验最终选择样品提取方法为：取粉碎混合均匀样品2 g于50 mL离心管，加入内标后于室温下加入甲醇-水（70+30）提取液10 mL，涡旋1 min，室温超声提取45 min，10 000 r/min离心5 min，将上清液转移至净化柱玻璃离心管，缓慢推进净化柱填料管，取上层净化液5 mL于氮吹管中50℃吹干，用流动相定容后过0.22 μm微孔滤膜。

2.1.4净化柱的选择

参照文献［13］资料，本试验通过加标回收的形式分别考察了ROMER公司生产的MycosepTM112、MycosepTM226和MycosepTM228多功能净化柱的净化效果，结果表明MycosepTM226多功能净化柱对6种组分回收率在82.1%～108.9%之间，MycosepTM112多功能净化柱仅对玉米赤酶烯酮组分净化损失较小，MycosepTM228多功能净化柱对6种待测组分回收率与MycosepTM226比较相对较低，故本次试验选择MycosepTM226多功能净化柱净化样品。

2.1.5质谱条件选择

根据各真菌组分化学电离性质，分别选用ESI+和ESI-模式，将真菌毒素标准储备液直接进样，通过优化质谱监测条件，确定各毒素的母离子质量数，结果发现玉米赤霉烯酮、雪腐镰刀菌烯醇、隐蔽型脱氧雪腐镰刀烯醇、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇和U-［13C15］-脱氧雪腐镰刀菌烯醇在ESI-模式下的灵敏度明显高于ESI+模式，故本方法采用ESI-模式监测。确定母离子质量数以后，根据欧盟2002657/EC检测组分确认规则，还需根据碰撞能量和碰撞电压来确认和优化两个以上子离子。最终6种真菌毒素及内标定性定量离子参数见表2，标准多反应监测（MRM）色谱图见图1。

2.2方法线性范围与定量下线

以空白小麦粉基体提取液配制标准系列使用液，以标准液与内标峰面积积分比值为纵坐标，以标准使用液标示浓度为横坐标进行自动积分，得到各检测组分线性回归方程、相关系数和线性范围，根据低浓度标准使用液监测离子峰，按照3倍信噪比（S/N）为最低检出限（LOD），10倍信噪比（S/N）计算定量线（LOQ），结果见表3。

从表3结果可以看出，采用内标法定量，各组分线性关系良好，相关系数R2均大于0.994，6个组分定量限在1.50 μg/k～3.00 μg/kg之间，远远低于我国粮食卫生标准对该类真菌毒素限值要求，能够满足该类产品的样品检测。

图16　种真菌毒素标准及U-DON内标多反应监测图谱Fig.1　MRM chromatograms for six kinds of mycotoxin standards and U-DON Internal standard

表3　6种真菌毒素的浓度范围、线性方程、相关系数、检出限与定量下线Table 3　Concentrations range，linear regression equations，correlation coefficients，detection limits and quantification limit for six kinds of mycotoxin

2.3方法加标回收与精密度

选择空白基质小麦粉样品，按照0.1C、0.5C和0.8C（C：为组分浓度范围上限）3个水平每个水平加标6个平行样品，添加真菌毒素混合标准溶液，震荡混匀后静置过夜，按优化样品处理和检测方法进行检测，结果见表4。

由表4可知，6种真菌毒素在50 μg/kg～400 μg/kg范围内样品加标回收率在82.1%～108.9%，相对标准偏差为4.6%～14.5%之间，能够满足实际样品检测要求。

2.4方法验证

国家风险评估中心于2014年8月对全国32个省级疾控中心及15个国家粮食质量检测中心开展了国家食品安全风险监测质控考核项目“面粉中脱氧学府镰刀菌烯醇检验”，结果用Z比分数法分析和评估，结果中位值为1.051 mg/kg，按照≤2为满意结果方式评价，本次质控考核全国总体满意率为68.1%（4个机构未上报），本实验室按照该方法对样品进行处理、检测，上报结果为0.916 mg/kg，经统计标准化IQR为0.076，Z值为-1.93，结果判定为满意。标明用该方法对面粉中该类真菌毒素检测结果可靠。

表4　6种真菌毒素的加标回收率及相对标准偏差（n=6）Table 4　The recovery rate and relative standard deviation for six kinds of mycotoxins

2.5实际样品检测

按照国家食品安全风险监测方案要求，2014年贵州省采用建立的方法在全省共采集158份小麦粉样品，对其玉米赤霉烯酮（ZEN）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇（3-DON）和15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇（15-DON）4种真菌毒素进行监测测定。结果48个样品中检出不同浓度水平的脱氧雪腐镰刀菌烯醇，样品检出率为30.38%，含量从24.6 μg/kg至1 206 μg/kg不等，其中有1份样品超过国家标准规定的限量要求，检出样品平均含量为256.7 μg/kg；共15份样品中检出玉米赤霉烯酮，样品检出率为9.49%，含量分别为6.4 μg/kg至32.4 μg/kg，检出样品平均含量为15.4 μg/kg，无超标样品；除此以外的其余毒素均未检出。

续表4　6种真菌毒素的加标回收率及相对标准偏差（n=6）Continue table 4　The recovery rate and relative standard deviation for six kinds of mycotoxins

3　结论

本文建立了超高液相色谱串联质谱法测定小麦粉中真菌毒素含量。对样品提取方式、液相色谱分离和质谱监测条件等关键因素进行优化，通过方法学考察、实验室能力验证和实际样品检测证明，该方法具有简便、快速、准确、可靠等特点，可适用于国家食品安全风险监测项目小麦粉中真菌毒素监测项目检测。

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Determination of Mycotoxins in Wheat Flour by UPLC-MS/MS

LIU Li-ya，LI Lei，ZHOU Yi-bing，WANG Ya-fang*
（Institute of Health Surveillance and Inspection of Guizhou Center for Disease Control and Prevention，Guiyang 550004，Guizhou，China）

The method to simultaneously determinate six kinds of common mycotoxins，included nivalenol （NIV），deoxynivalenol concealed（Deepoxy-DON），deoxynivalenol（DON），deoxynivalenol derivatives（3ADON，15A-DON）and zearalenone（ZEN）in wheat flour was established.The samples were purified with multifunctional purifying column，then determinated by liquid chromatography tandem mass spectrometry with internal standard method.The results showed detection limits of six kinds mycotoxin were between 0.50 μg/kg and 1.00 μg/kg，the linear correlation coefficient R2＞0.994，three levels recovery were 82.1%-108.9%，RSD were 4.6%-14.5%.The method used to ability verification and quality control assessment of deoxynivalenol in wheat flour，statistical results Z score was-1.93，the result was evaluated as satisfactory.The method is accurate，sensitive and efficient and applicable to quantitative analysis of six kinds of common mycotoxin in wheat flour.

liquidchromatography-tandemmassspectrometry；multifunctionpurification；internalstandard

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.15.040国北方在居民膳食摄入中占比重较大，小麦粉中常见真菌毒素检测是食品生产原料质量控制的最后程序，对保障居民身体健康至关重要，因此目前我国将小麦粉中常见真菌毒素监测作为食品安全风险监测工作的常规检测内容。

贵州省传染病预防与控制人才基地（黔人领发［2013］15号）作者简介：刘利亚（1978—），男（汉），副主任技师，大学本科，从事环境及食品卫生检验。

王娅芳（1976—），女，主任医师，从事营养及食品卫生检验。

2015-08-14