β-环糊精超声辅助提取山楂中熊果酸的研究

石瑞，张宁，李志英，何瑞瑞，余慧菁（忻州师范学院生物系，山西忻州034000）

β-环糊精超声辅助提取山楂中熊果酸的研究

石瑞，张宁，李志英，何瑞瑞，余慧菁
（忻州师范学院生物系，山西忻州034000）

研究超声辅助β-环糊精（β-CD）介质中提取山楂中的熊果酸，分光光度法测定山楂中熊果酸的得率。在单因素试验的基础上，采用正交试验，以山楂中的熊果酸含量为指标，分别考察所选的各因素对超声波法提取工艺的影响，并研究其抗菌作用。结果表明：最佳的提取工艺条件为乙醇浓度为80%，超声波功率240 W，超声提取时间30 min，液料比30∶1（mL/g），温度为50℃，β-CD的用量m（山楂）∶m（β-CD）为1∶1为最佳工艺条件。山楂中的熊果酸得率为：7.264 mg/g。β-CD的加入有效的提高了熊果酸的得率。通过对照试验可知熊果酸对大肠杆菌，枯草杆菌具有抗菌作用。

山楂；熊果酸；超声波法；β-环糊精

山楂为蔷薇科植物山里红（Crataegus pinnatifida Bge.Var.magcr N.E.Br）及大果山楂C.pinnatifida Bge.的干燥成熟果实，主要功能为消食健胃、行气散瘀。为药食两用的药材，据文献报道，山楂中含有熊果酸等三萜类成分［1］。

熊果酸，又名乌索酸［2］，具有广泛的生物学活性，如抗菌瘤、抗肝炎、抗病毒、抗辐射、抗氧化、降血糖、降血脂、降血压、提高免疫力、美白等［3-6］，广泛的用于医药、保健食品及化妆品等领域。

环糊精（CD）具有疏水性的内腔和亲水性的表面，是超分子化学中的基础物质之一，它的包合特性使其在理论及实际应用中得到迅速发展［7］。尤其在医药方面，CD和CD衍生物与传统药物载体材料相比，具有无毒，性质稳定等特点，此外，它结构独特，可用于提高药物溶解度和稳定性，增强药物利用率［8-9］。

近年来超声波法提取方法作为一种优良的提取方法已经广泛应用于天然植物中有效成分的提取［10-13］。本试验通过拟使用β-环糊精的醇溶液通过超声辅助方法提取山楂中的熊果酸，以期代替了传统的水浸法，醇提法，以提高山楂中熊果酸的提取效率。优化超声提取山楂中熊果酸的最佳工艺条件。

1　材料和方法

1.1材料、试剂与仪器

山楂；熊果酸标准品；香草醛；高氯酸；冰醋酸；β-环糊精；试验试剂均为分析纯，试验用水为一次蒸馏水。

0.1 mg/mL熊果酸标准溶液的制备：准确称取熊果酸标准品0.010 0 g，以无水乙醇为溶剂，定容于100 mL容量瓶中，即得0.1 g/mL的熊果酸标准品。

0.05 g/mL的香草醛-冰醋酸溶液的制备：取2.50 g香草醛，然后用冰醋酸定容到50 mL。

电子天平（FA2204B）：上海精密科学仪器有限公司；紫外可见分光光度计（UV-2550）：岛津公司，苏州；HH-2型数显恒温水浴锅）：江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；中草药粉碎机（FW135型）：天津市泰斯特仪器有限公司；KQ-400KDE型高功率数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司。

1.2原料预处理

取干山楂，去除杂质，用粉碎机粉碎。过60目筛，得到山楂粉末，储藏备用。

1.3山楂中熊果酸的提取方法

称取山楂粉末1 g于容量瓶中，用80%乙醇提取，超声波功率为60%，液料比为30∶1（mL/g），温度为50℃，β-CD的用量m（山楂）∶m（β-CD）为1∶1，超声波辅助提取30 min。冷却至室温，脱色［14］。过滤，将所得滤液定容到50 mL容量瓶中作为样品提取液。

1.4山楂中熊果酸的测定方法

使用香草醛-冰醋酸法［1］。

熊果酸得率的计算公式：得率/（mg/g）=250×1000×（吸光度A+0.015 5）/0.027 4

1.5培养基的制备

普通琼脂培养基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，琼脂条20 g，水1 000 mL，灭菌前浓度2 mol/L，用氢氧化钠调pH值至7.0～7.2。

1.6菌悬液的制备

将供试菌种接种于普通琼脂培养基上，进行斜面活化，恒温37℃培养18 h～24 h，用接种环挑取单个菌落分别接种于新鲜肉汤培养基中，置37℃恒温箱中培养18 h～24 h，采用灭菌水稀释菌悬液后备用。

2　结果与分析

2.1吸收光谱的研究

按1.3的试验方法提取，以试剂空白作参比，在400nm～800nm之间测定吸光度，所得谱图如图1所示。

由图1可知，当提取介质为β-CD乙醇溶液时，山楂中熊果酸的得率最高，β-CD能够增加熊果酸的得率，计算此条件下的熊果酸得率为：5.152 mg/g。比传统方法得率提高1.41倍，故选择β-CD+乙醇为山楂中熊果酸的提取介质。

2.2乙醇浓度对熊果酸得率的影响

准确称取1 g山楂粉末，固定其它条件不变，只改变乙醇浓度：10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%，按1.3的方法提取，按1.4的方法测定，结果见表1。

由表1知，随着乙醇浓度的增大，山楂中熊果酸得率也在增大，浓度超过80%时，增大幅度不大。考虑其节省药品及得率。故取80%的乙醇为提取溶剂。

2.3超声波提取功率的影响

图1　 紫外光谱图Fig.1　The UV absorbance spectrum

准确称取1 g山楂粉末，固定其它条件不变，只改变超声波功率：160、200、240、280、320 W，按1.3的方法提取，按1.4的方法测定，结果见表2。

表2　超声波功率对熊果酸得率的影响Table 2　Effect of ultrasonic power on extraction of ursolic acid

表1　乙醇浓度对熊果酸得率的影响Table 1 Effects of ethanol concentrations on extraction of ursolic acid

由表2，随着超声波提取功率的增大，山楂中熊果酸得率也在增大，且有下降趋势。考虑其节能方面及得率。故取功率240 W为最优超声波提取功率。

2.4超声波提取时间的影响

准确称取1 g山楂粉末，固定其它条件不变，只改变超声波时间：15、20、30、45、60 min，按1.2.2的方法提取，按1.4的方法测定，结果见表3。

表3　提取时间对熊果酸得率的影响Table 3　Effects of extracting time on extraction of ursolic acid

由表3可知，随着超声波提取时间的增大，得率先增大，后减小。后半段时间可能是由于提取时间过长，部分熊果酸分解等原因造成。综上，30 min为最优超声波提取时间。

2.5液料比的选择

准确称取1 g山楂粉末，固定其它条件不变，只改变液料比：10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1（mL/g），按1.3的方法提取，按1.4的方法测定，结果见表4。

表4　 液料比对熊果酸得率的影响Table 4　Effects of liquid-solid ratio on extraction of ursolic acid

由表4可知，随着液料比的增大，得率先增大后减小，在液料比为30∶1（mL/g）时得率最高，故选取30∶1（mL/g）为最佳液料比。

2.6β-CD用量的选择

准确称取1 g山楂粉末，固定其它条件不变，只改变β-CD的量m（山楂）∶m（β-CD）为1∶0.5、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4，按1.3的方法提取，按1.4的方法测定结果见表5。

表5 β-CD用量对熊果酸得率的影响Table 5　Effects of β-CD dosage on extraction of ursolic acid

由表5可知，随着β-CD的增加，吸光度先增大后减小。综合考虑。故选择m（山楂）∶m（β-CD）=1∶1。

2.7温度的选择

准确称取1 g山楂粉末，固定其它条件不变，只改变温度：30、40、50、60、70℃，按1.3的方法提取，按1.4的方法测定，结果见表6。

表6　 温度对熊果酸得率的影响Table 6　Effects of temperature on extraction of ursolic acid

由表6知，随着温度的升高，得率先增加后减小，在温度为50℃时熊果酸有最大得率，故选择温度为50℃。

2.8正交试验

根据以上单因素试验结果，选出影响熊果酸得率的4个因素：超声波提取时间、超声波提取功率、液料比、温度。进行优化组合，以所测得吸光度为查考指标，采用L9（34）进行正交试验，优选出超声波辅助β-CD提取法提取山楂中熊果酸的最佳工艺参数。正交试验因素水平如表7所示。

表7　正交试验因素水平Table 7　Factors and levels in the orthogonal array design

2.9超声波法正交试验极差结果分析表

超声波法正交试验极差结果分析表见表8。

表8　超声波法正交试验极差结果分析表Table 8　The results of range analysis of orthogonal experiments by ultrasonic method

由极差分析可知，各因素对熊果酸提取影响因素大小为：A（时间）＞D（温度）＞B（液料比）＞C（超声波功率）。故最佳试验方案是：A1B1C2D2，即超声波时间为30 min，液料比为20∶1（mL/g），超声波功率为240 W，温度为50℃。计算在此条件下的熊果得率为7.264 mg/g。而单因素的最佳提取条件下得率为6.346 mg/g，二者相差不大。

3　抗菌作用的研究

3.1熊果酸抗菌效果

在超净工作台上用接种环挑取各供试菌的单个菌落划线于药物平板上，同时以不加药物、只加菌悬液的琼脂平板作阳性对照，加无菌水于阴性平板上作阴性对照。然后将平板倒置于37℃恒温箱中培养18 h～24 h，取出观察结果。结果见图2～图3及表9。

图2　熊果酸对枯草杆菌的抑菌效果图Fig.2　The antibacterial effect of Bacillus subtilis

图3　熊果酸对大肠杆菌的抑菌效果Fig.3　The antibacterial effect of Escherichia coli

表9　 生长抑制试验结果Table 9　Results of growth inhibition test

由表9可知，熊果酸对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌均有抗菌作用，且熊果酸对枯草芽孢杆菌的抑菌效果强于大肠杆菌的抑菌效果。

4　结论

在单因素试验的基础上通过正交法试验的优化，获得超声波提取山楂中熊果酸的最佳工艺条件：乙醇浓度为80%，超声波功率240 W，提取时间30 min，温度为50℃，液料比30∶1（mL/g），m（β-CD）∶m（山楂）=1∶1，此时山楂中熊果酸的提取得率达7.264 mg/g。β-CD的加入有效地增加了山楂中熊果酸的得率。

［1］赵爱云，张立新，王能飞，等.山楂中熊果酸的提取工艺研究［J］.食品工业科技，2006，27（11）：127-128

［2］李满秀，刘美云.山楂中熊果酸的超声提取及抗氧化性研究［J］.食品工业科技，2010，31（4）：280-282

［3］彭雪萍，王花俊，纵伟，等.β-环糊精与熊果酸在乙醇溶液中的包合效果研究［J］.中国食品添加剂，2010，5（3）：157-159

［4］占豪，姜子涛，李荣.紫外光谱法研究罗勒精油与β-环糊精的包合作用［J］.中国调味品，2008，15（1）：13-17

［5］关皓月，张纯，顾伟峰.紫外分光光度法测定盐酸奈福泮-β-环糊精包合物的含量［J］.药学实践杂质，2008，26（4）：291-293

［6］Valerian T D，K enny.B L Introduction and general overview of cyclodextrin chemistry［J］.Chem Rev，1998，98（5）：1741-1742

［7］童林荟.环糊精化学—-基础与应用［M］.北京：科学出版社，2001：1-8

［8］张钰，程度胜.β-环糊精及衍生物再生物制药领域中的应用［J］.生物技术通讯，2003，14（5）：433-435

［9］任光明，徐芬，李志英.微波提取生地多糖的工艺研究［J］.现代食品科技，2010，23（3）：51-52

［10］王延峰，李延清，郝永红，等.超声波法提取银杏叶黄酮的研究［J］.食品科学，2002，23（8）：166-167

［11］冯涛.竹叶总黄酮提取及纯化工艺的研究［D］.天津：天津科技大学，2003：19-22

［12］周斌.用超声波提取中药材［J］.安徽科技，2005（4）：23-24

［13］胡忠泽，谭志静，杨久峰，等．超声提取姜黄素最佳工艺研究［J］.中国实验方剂学志，2005，11（2）：6-7

［14］李跃忠，纵伟，董海丽，等．枇杷叶中熊果酸的提取、分离工艺研究［J］.食品与生物，2008，112（3）：5-6

Study on the Ursolic Acid Ultrasonic-assisted Extraction of β-Cyclodextrin from the Hawthorn

SHI Rui，ZHANG Ning，LI Zhi-ying，HE Rui-rui，YU Hui-jing
（Department of Biology，Xinzhou Teachers University，Xinzhou 034000，Shanxi，China）

To study the extraction of ursolic acid from Hawthorn by ultrasonic-assisted β-CD.The yield of the ursolic acid was determined by UV-spectrophotometry，based on the single factor test and orthogonal test using ursolic acid as an index.The influence of various factors on the extraction process of ultrasonic wave was detected.The optimum extraction conditions were 80%ethanol concentration，ultrasonic power of 240 W，extraction time of 30 min，liquid-solid ratio of 30∶1（mL/g），the temperature of 50℃，β-CD of the amount m（hawthorn）∶m（β-CD）of 1∶1.Ursolic acid yield of Hawthorn：7.264 mg/g.The yield of ursolic acid was obviously increased in the presence of β-CD.The results shows of contrast test：ursolic acid on escherichia coli，bacillus subtilis has antibacterial effect.

crataegus；ursolicacid；ultrasonic-assisted；β-cyclodextrin

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.15.022

忻州师范学院青年基金项目（20126）

石瑞（1985—），女（汉），助教，硕士，主要从事植物营养及逆境生理生化研究。

2016-01-04