L-赖氨酸免疫磁性微球制备及其应用研究

李鹤，徐丹，李晓凤（西华大学食品与生物工程学院，四川成都610039）

L-赖氨酸免疫磁性微球制备及其应用研究

李鹤，徐丹，李晓凤
（西华大学食品与生物工程学院，四川成都610039）

采用化学共沉淀法制备Fe3O4纳米微粒，并对其粒径大小、磁响应性和磁分散性进行综合分析。利用反向悬浮包埋法，以Fe3O4纳米微粒为载体制备L-赖氨酸高分子微球，并将其运用于猪血清中蛋白的分离。以猪血清蛋白偶联率为指标，通过正交试验优化L-赖氨酸高分子微球作用于猪血清蛋白的最佳作用条件。结果表明：最佳作用条件为反应温度40℃，作用时间3h，血清用量20mL，在此条件下测得猪血清蛋白的偶联率达到18.59%。

Fe3O4纳米微粒；L-赖氨酸；猪血清蛋白；偶联率

1　材料与方法

1.1材料与仪器

1.1.1设备

JJ-1型精密增力电动型搅拌器：上海雷韵试验仪器制造有限公司；JY92-2D型超声波细胞粉碎机：宁波

纳米微粒是指颗粒尺寸为纳米量级的超细微粒，它的尺度大于原子簇（cluster），小于通常的微粉，一般在1 nm～200 nm之间。纳米微粒具有巨大的比表面积、表面原子数、表面能和表面张力。当小粒子尺寸进入纳米量级（1 nm～200 nm）时，其本身具有量子尺寸效应，小尺寸效应，表面效应和宏观量子隧道效应，因而展现出许多特有的性质，在热、磁、光、敏感特性和表面稳定性等方面展现出有别于常规粒子的特性［1-2］。

磁性高分子微球具有很好的磁性，在磁场作用下可定向运动到特定部位，或迅速从周围介质中分离出来，且质轻，易加工，流动性好，在细胞生物学（细胞分离、细胞标记等），生物医学（靶向药物、临床诊断等）和生物工程（酶的固定化等）等诸多领域展现了广阔的研究和应用前景［3-4］。尤其是纳米级磁性高分子微球，由于粒径小，比表面积大，可偶联的生物分子容量大，且能分散在体系中不易沉降，非常适合在生物体系中使用。这些性能使其具有广阔的应用前景，因而在生化分离、新芝生物科技股份有限公司；752型紫外可见分光光度计：上海昂拉仪器有限公司；ZK-82B型真空干燥箱：上海精密仪器仪表有限公司；ME100系列生物显微镜：浙江赛因科学仪器有限公司。

1.1.2试剂

FeCl2·4H2O、FeCl3·6H2O、NaOH、聚乙二醇（PEG）、氯化钠、碳酸氢钠、磷酸钾、乙腈、溴化氰（CNBr）、琼脂糖、四硼酸钠、二氯乙烷、司班-80、液体石蜡、环氧氯丙烷、十六醇、柠檬酸三钠、L-赖氨酸盐酸盐（C6H14N2O2·HCl）等（均为分析纯）：购于成都科龙试剂化学试剂厂。Sepharose 4B：上海荣君生物医药科技有限公司。

1.2方法

1.2.1Fe3O4纳米粒子的制备

1.2.1.1Fe3O4纳米粒子的制备［8-9］

采用化学共沉淀法，将0.8 mol/L FeCl2溶液与0.8 mol/L FeCl3溶液各50 mL加入三颈瓶中，搅拌，混合均匀，加热并冷凝回流；升温至50℃时，缓慢滴加6 mol/L的NaOH溶液80 mL，再加热至80℃熟化30 min，搅拌，冷却；加入表面活性剂聚乙二醇（PEG），降至室温后，抽滤，用去离子水洗涤，真空干燥，即得纯黑色的Fe3O4粒子。该反应的方程式为：

FeCl2+2FeCl3＋8NaOH=Fe3O4↓+8NaCl+4H2O（1）

1.2.1.2Fe3O4纳米粒子的磁悬浮性的测定

利用ME100系列生物显微镜初步测定粒子粒径；用752型紫外可见分光光度计测定粒子磁悬浮性及磁响应性［10］。在1500高斯的磁铁环境下沉降10 min后，吸取试管1/2处溶液，检测其透光率，透光率值间接反映磁响应效果。其中，透光率越高则磁响应性越高；自然条件下沉降5 h后，吸取试管1/2处溶液，检测其透光率，透光率值间接反映磁分散效果，如果透光率越低则磁悬浮性越好。

1.2.2Fe3O4纳米粒子制备条件优化

改变电动搅拌器转速、表面活性剂聚乙二醇（PEG）加入量并测定微球粒径、磁悬浮及磁响应性进行试验，以Fe3O4纳米粒子的粒径为指标，筛选得到Fe3O4纳米粒子制备的优化条件，试验因素水平见表1。

表1　Fe3O4纳米粒子制备因素水平表Table 1　The factors and levels of preparation of Fe3O4nanoparticles

1.2.3L-赖氨酸高分子微球的合成

1.2.3.1琼脂糖凝胶Sepharose 4B的活化

在通风橱内称取0.566 g溴化氰，加12 mL乙腈，加盖后温和摇动，使之溶解。将Sepharose 4B用G3砂芯漏斗抽干，加入5 mol/L的磷酸钾溶液并搅拌，滴加CNBr-乙腈溶液，10 min内滴完，再搅拌10 min，然后洗净，将湿凝胶冰箱备用。

1.2.3.2CNBr-琼脂糖4B与L-赖氨酸盐酸盐的偶联［11-12］

取L-赖氨酸1.125 g溶于36 mL 0.2 mol/L NaHCO3溶液中，混合均匀。取样0.5 mL加入4.5 mL蒸馏水于280 nm波长测其吸光度为0.212。量取上述溶液32 mL，将已活化好的湿凝胶4 g溶于其中，得溶液（A液）35 mL，室温下用磁力搅拌2 h，然后放入4℃冰箱中过夜。

次日，将上述溶液用G3砂芯漏斗抽滤，再用每升含0.2 mol NaCl 0.01 mol/L的磷酸钾溶液100 mL冲洗凝胶，共得液体（B液）129.5 mL，取样在280 nm波长处测吸光度为0.112，然后再用每升含0.15 molNaCl的0.01 mol/L的磷酸钾溶液150 mL冲洗凝胶，收集得到的洗液共374 mL（C液），取样在280 nm波长处测吸光度为0.125。

1.2.3.3L-赖氨酸高分子微球的制备

利用反向悬浮包埋法制备L-赖氨酸高分子微球。先将水相（L-赖氨酸-Sepharose 4B1.0 g、0.5 g铁磁粉、5 mL、100 g/L的NaOH、50 mg NaBH4）混合均匀，70℃溶胀2 h，然后将水相迅速转移至有机相（18mL液体石蜡、12 mL二氯乙烷、1.0 mL司班-80、1.0 mL环氧氯丙烷）中并加入0.2 g十六醇，70℃恒温加热并搅拌4 h。抽滤并用水、体积分数为20%的乙醇水溶液、水依次洗涤以除去残留的有机相，真空干燥得到产物，放入冰箱备用。

1.2.4L-赖氨酸高分子微球分离猪血清蛋白条件优化

按表2，取一定量L-赖氨酸高分子微球与猪血清蛋白充分混合，水浴，在280 nm处测定其吸光度。在前期单因素试验的前提下，以对试验影响因素较大的反应温度、作用时间以及血清量进行三因素三水平的正交试验，试验因素水平见表2。

表2　正交试验因素水平表L9（33）Table 2　The factors and levels of orthogonal experiment

2　结果与讨论

2.1Fe3O4纳米粒子的性能表征

2.1.1Fe3O4纳米粒子的粒径分析

利用显微镜，在目测尺的辅助下，放大1 000倍，用目测尺测量Fe3O4纳米粒子的粒径。为了尽量减小试验误差，本试验采用多次测量取其平均值，试验所测得的粒径数据见表3，在不同PEG添加量及不同转速下的Fe3O4纳米粒子粒径大小的曲线图如图1所示。

图1　不同转速及PEG添加量对Fe3O4磁性微球粒径大小影响Fig.1　Effects of different rotational speed and PEG addition on Fe3O4magnetic microspheres particle size

表面活性剂在纳米粉体分散中起到的作用主要有两方面：一是在纳米微粒表面吸附，形成表面膜，防止颗粒再团聚；二是形成的表面膜亲油基部分与介质相容性好，亲和力强。由图1可知，在转速一定的情况下，随着PEG用量的增加，Fe3O4纳米粒子的直径也跟着变小；当PEG用量一定的情况下，随着转速的增加，Fe3O4纳米粒子的直径越来越小。这是因为在初始阶段，液滴的存在是一个动态的过程，液滴不断被聚并又不断的重新生成，搅拌速度增大，剪切力增大，反应体系处于湍流状态，液滴周围存在这较强的压力波动和相对速度波动，当液滴和周围液体相对速度达到足以使液滴边缘不稳定时，小液滴就会从大液滴上脱离，形成若干个小液滴［13］。

2.1.2Fe3O4纳米粒子的磁响应及磁分散测定

透光率值可以间接地反映磁响应和磁分散效果，将在不同PEG添加量和不同转速下得到的Fe3O4纳米粒子分别称取1.0 g放入试管中，再加入20 mL无水乙醇，在1 500高斯的磁铁环境下沉降10 min，测定Fe3O4纳米子粒的磁响应性，在自然条件下沉降5 h Fe3O4纳米子粒的磁分散性，其试验结果的平均值见表4。不同转速及PEG添加量对Fe3O4磁性微球磁响应和磁分散性的影响分别如图2和图3所示。

图2　不同转速及PEG添加量对Fe3O4磁性微球磁响应的影响Fig.2　Effects of different rotational speed and PEG addition on Fe3O4magnetic microspheres magnetic responsivity

图3　不同转速及PEG添加量对Fe3O4磁性微球磁分散的影响Fig.3　Effects of different rotational speed and PEG addition on Fe3O4magnetic microspheres magnetic dispersion

由图2可知，在PEG用量一定的情况下，转速越大，透光率越大，则表明Fe3O4纳米粒子的磁响应性越好；在转速一定的情况下，随着PEG剂用量的增加，透光率越来越大，则所制得的Fe3O4纳米粒子的磁响应性就越好；当PEG添加量高于3 mL时，曲线趋于缓和，表明此时PEG添加量对Fe3O4纳米粒子吸光度的影响越来越小，即对制得产品的磁响应性影响也越来越小。

由图3可知，在PEG用量一定的情况下，转速越大，透光率越大，则表明Fe3O4纳米粒子的磁分散性越好；在转速一定的情况下，随着PEG剂用量的增加，透光率呈略微下降趋势，但其变化幅度不大，即PEG添加量对Fe3O4磁性微球磁分散的影响不大。

综上所述，Fe3O4磁性微球的制备条件为PEG添加量为3 mL及搅拌转速为2 000 r/min，能使Fe3O4磁性微球具有较好的响应性和分散性。

2.2L-赖氨酸在高分子微球合成中的偶联率计算

对合成L-赖氨酸高分子微球过程中的吸光值进行测定，其结果见表3，并按公式（1）计算得到CNBr-琼脂糖4B与L-赖氨酸盐酸盐的偶联率=17.88%。

2.3L-赖氨酸高分子微球分离猪血清蛋白正交试验结果分析

将新鲜猪血离心后，在280 nm下用752型紫外可见分光光度计测定其血清的吸光度，吸光度值为2.699，根据公式（1），其正交试验结果见表4，正交试验结果分差分析见表5。

表3　CNBr-琼脂糖4B与L-赖氨酸盐酸盐的偶联中各种溶液的吸光度值Table 3　The absorbance values of various of solution in the coupling between CNBr-Sepharose 4B and L-lysine hydrochloride

表4　L-赖氨酸高分子微球分离猪血清蛋白正交试验结果Table 4　The results of orthogonal experiment of IgG Separation with L-lysine polymer microsphere

表5　正交试验的方差分析Table 5　Orthogonal analysis of variance

从表5可以看出影响血清蛋白偶联率的主次因素为C（血清用量）＞B（作用时间）＞A（温度）；根据各因素的主次关系和最大K值对应的水平选出最佳试验方案为C3B3A2，整理顺序得A2B3C3。即反应温度为40℃、作用时间3 h、血清用量20 mL。

2.4验证试验

将反应温度设定为40℃、作用时间为2 h、血清用量20 mL进行3组验证试验，试验结果如表6所示。

表6　验证试验结果Table 6　The results of verification test

验证试验结果表明：在反应温度为40℃、作用时间2 h、血清用量20 mL时，其血清蛋白偶联率为18.55%，与正交试验中最优结果相差不大，综合考虑，可确定反应温度为40℃、作用时间2h、血清用量20mL为最佳作用条件。

3　结论

采用化学共沉法制备Fe3O4纳米粒子，表面活性剂聚乙醇（PEG）用量为3mL、电动搅拌器转速2000r/min时，制得的Fe3O4纳米粒子具有较好的磁响应性和磁分散性、且粒径达到200 nm以内，在显微镜观察下呈均匀分布状态。

采用Fe3O4磁性微球作载体制备L-赖氨酸高分子微球，将其运用于猪血清中蛋白的分离，并采用正交试验对其最佳作用条件进行了优化，得到最佳作用条件为反应温度为40℃、作用时间3 h、血清用量20 mL，在此条件下测得血清蛋白的偶联率达到18.59%。

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Research on the Separation of L-lysine Immunomagnetic Microspheres Serum Protein

LI He，XU Dan，LI Xiao-feng
（School of Food and Biological Engineering，Xihua University，Chengdu 610039，Sichuan，China）

This experiment used chemical Co-precipitable to get Fe3O4particles，then analyzed its particle size，magnetic response and magnetic dispersion.Use Fe3O4nanoparticles as carriers for the preparation of L-lysine polymer microsphere by reverse suspension method，which was applied to the separation of pig serum protein.Coupled rate with the pig's serum was used as a target to optimize the technical conditions through the orthogonal experiments.The results showed that the best condition was as follow，the reaction temperature was 40℃，the reaction time was 3 h and the serum dosage was 20 mL，under these conditions the serum protein coupling rate could reach to 18.59%.

Fe3O4particles；L-lysine；pig'sserumproteins；coupledrate靶向制剂、固定化酶、免疫分析、催化研究等方面有极为广泛的应用［4-5］。Nakamura等［6］把细菌磁微球用于分离血清中免疫球蛋白IgG的含量。Fabregas等［7］将IMMS用磁场固定在一个平板换能器上，制得一种新型免疫传感器，并将其应用于流动分析系统，能够分离出样品中微摩尔级浓度的兔抗IgG。免疫高分子磁性微球具有巨大的应用前景和潜力，但国内的研究水平与国际水平相比还有很大的差距。本试验采用化学共沉淀法制备Fe3O4粒子，并对其磁响应性、磁分散性和粒径大小进行综合分析，得到纳米分散的Fe3O4粒子。利用反向悬浮包埋法将L－赖氨酸包裹于Fe3O4粒子磁性微球表面，得到L-赖氨酸高分子磁性微球，并将其运用于猪血清中蛋白的分离，优化其最佳工艺条件，为L-赖氨酸高分子磁性微球的制备及其应用提供一定的理论参考。

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.15.031

四川省大学生创新创业训练计划项目（201510623055）

李鹤（1982—），女（白），讲师，硕士，研究方向：食品生物技术。

2015-08-10