播散性浅表性光化性汗孔角化症MVK基因突变检测

Parimi Leela Rani　付希安　王真真　杨宝琦　施仲香　刘　红　张福仁1，

·论著·

播散性浅表性光化性汗孔角化症MVK基因突变检测

Parimi Leela Rani1，2#付希安1，2，3#王真真3杨宝琦3施仲香3刘红3张福仁1，3

目的：检测2个中国汉族播散性浅表性光化性汗孔角化症（DSAP）家系患者MVK基因突变。方法： 提取2个DSAP家系及100名无亲缘关系的健康对照外周血DNA，采用PCR扩增患者MVK基因的全部外显子及其侧翼序列，用Sanger测序法对PCR扩增产物直接测序检测基因突变。结果：发现1个新的剪切位点突变（c.1040-2A＞C）和1个已报道的错义突变（c.1094T＞C）。结论：本研究进一步证实MVK基因突变与DSAP发病相关。

播散性浅表性光化性汗孔角化症； MVK基因； 基因突变

播散性浅表性光化性汗孔角化症（disseminated superficial actinic porokeratosis，DSAP）是汗孔角化症最常见的类型［1］，1969年由Anderson等［2］首次描述，属常染色体显性遗传。DSAP皮损以曝光部位数量较多，形态不规则，中央轻度萎缩，边缘呈嵴状隆起的浅褐色离心性环状斑为特征，典型的病理特点为角化不全柱。该病具有遗传异质性，既往曾有多个致病区域被报道。2012年国内学者通过外显子测序研究发现MVK基因突变可导致本病的发生［3］。MVK位于12q24，包含10个编码的外显子及1个不编码的外显子，对角质形成细胞的分化有着主要影响。本研究收集2个DSAP家系患者，通过聚合酶链反应（PCR）及DNA直接测序对MVK基因进行了检测，以期发现其是否存在新的突变位点。

1　资料与方法

1.1临床资料 本研究对象为2个DSAP家系（图1）。2个先证者均由山东省皮肤病性病防治研究所的皮肤科专家结合临床和组织病理学检查诊断为DSAP患者。此外，我们选取了100名与DSAP患者无血缘关系的正常对照。

1.2试验材料 外周血DNA的提取:经患者和正常对照知情同意后，留取详细的临床资料和临床图片及组织病理检查结果，同时取患者及家系正常个体静脉血各5 mL，放置在EDTAK2抗凝管中，存入-80℃冰柜冷冻保存，采用AXYGEN试剂盒提取基因组DNA。取适量DNA进行纯度检测并标化。

1.3方法 MVK基因全部外显子的PCR扩增参照文献设计特异性引物10对［4］，扩增包括10个外显子及其与内含子交界区的序列。PCR反应在9700型PCR扩增仪（美国ABI公司）上完成。扩增条件: 94℃预变性3 min后，94℃变性30 s，退火45 s，72℃延伸45 s，35个循环。最后72℃延伸8 min，4℃保存。总反应体系25 μL。纯化后的PCR产物采用3130xl遗传分析仪（美国ABI公司）直接测序。

图1　2个DSAP家系的家系图

2　结果

通过对MVK基因整个编码区的10条外显子及其侧翼序列直接测序发现:家系1先证者及家系内其他患者均在10号内含子区域发现1个新的剪切位点突变（c.1040-2A＞C）（图2）；家系2先证者及家系内其他患者均发现一个既往报道的错义突变（c.1094T＞C）（图3），导致苯丙氨酸突变成丝氨酸（p.Phe364Ser）。以上突变均经反向测序证实。家系中未发病成员及正常对照组经测序均未发现以上突变。

图2　A.家系1先证者MVK基因突变c.1040-2A＞C，位于11号外显子上游2个碱基，为剪切位点突变；B.正常对照的测序结果

图3　A.家系2先证者MVK基因突变c.1094T＞C，位于11号外显子，为错义突变；B.正常对照的测序结果

3　讨论

DSAP是一种表现为皮肤角化异常的常染色体显性遗传病，具有遗传异质性，其遗传学基础和发病机制尚未完全明确。传统基因检测方法共定位了DSAP的5个致病区域12q23.2-24.1，1p31.3-p31.1，18p11.3，16q24.1-24.3，12q21.2-24.21［5-9］，但未发现其致病基因。2012年，国内学者首次通过外显子测序方法对一个DSAP家系进行研究，发现一个新的致病基因MVK，并在57个DSAP家系及25个散发DSAP患者中进行了验证，结果在33%的家系和16%的散发患者中发现了13个MVK基因突变位点［3］。2014年，国内其他学者采用同样方法，对2个DSAP家系患者进行分析，发现另外一个新的致病基因SLC17A9［10］。迄今，国内外尚无其他团队对SLC17A9基因在汗孔角化症中进行验证。2015年，Zhang等，通过连锁分析、候选基因方法及MiSeq二代测序技术对134例（61例家系，73例散发）汗孔角化症进行研究，发现了除MVK外的其它3个新的致病基因（PMVK，MVD，FDPS）［11］。以上4个基因均位于甲戊二羟酸途径合成类异戊二烯通路上，该通路在细胞生成过程中有着重要的影响。但本研究只对汗孔角化症进行致病基因研究，并未进行临床型别分析。

MVK作为DSAP发病明确的致病基因，迄今共发现40余种突变位点［4，11-13］。该基因位于12q24，包含10个编码的外显子及1个不编码的外显子。MVK基因共存在四个保守区域，包括位于N端的ATP结合结构域及C端的PTS2结构域。在人体的多个组织中MVK都有表达，其中包括皮肤的表皮细胞，而且MVK编码的是甲羟戊酸通路的关键酶，此通路在细胞生成过程中有着重要的影响，提供许多细胞所必须的基本活性物质。Zhang等采用建立细胞模型的方法来分析研究MVK基因在角质形成细胞的增殖、分化、凋亡过程中的影响。研究发现:MVK对角质形成细胞增殖影响的研究中，实验组和对照组之间并没有显著的统计学差异；但MVK对角质形成细胞的分化有着主要影响，当MVK过度表达时，棘层的角质形成细胞分化标志-角蛋白1表达增多，颗粒层分化标志蛋白也表达增多，而且通过流式细胞仪检测到MVK的表达能够有效地保护细胞免于UVB引起的细胞凋亡［3］。

本文通过对2个DSAP家系进行MVK致病基因突变研究，检测到一个新的剪切位点突变和一个既往报道的点突变。以上2个突变均位于MVK基因第四个保守区域之内，此区域内的突变可能会影响角质形成细胞的分化及由UVB所导致的细胞凋亡的升高。本研究进一步证实MVK基因突变与DSAP发病相关。

［1］Chernosky ME.Porokeratosis［J］.Arch Dermatol，1986，122: 869-870.

［2］Anderson DE，Chernosky ME.Disseminated superficial actinic porokeratosis.Genetic aspects［J］.Arch Dermatol，1969，99:408-412.

［3］Zhang SQ，Jiang T，Li M，et al.Exome sequencingidentifies MVK mutations in disseminated superficial actinic porokeratosis［J］.Nat Genet，2012，44（10）:1156-1160.

［4］徐媛媛，于功奇，付希安，等.播散性浅表性光化性汗孔角化症MVK基因突变分析［J］.中国麻风皮肤病杂志，2015， 31（2）:77-81.

［5］Cao HM，Wang ZY，Zhang GW，et al.Identification of a locus（DSP2）for disseminated superficial porokeratosis at chromosome 12q21.2-24.21［J］.Clin Exp Dermatol，2012，37（6）:672-676.

［6］Liu P，Zhang S，Yao Q，et al.Identification of a genetic locus for autosomal dominant disseminated superficial actinic porokeratosis on chromosome 1p31.3-p31.1［J］.Hum Genet，2008，123（5）:507-513.

［7］Luan J，Niu Z，Zhang J，et al.A novel locus for disseminated superficial actinic porokeratosis maps to chromosome 16q24.1-24.3［J］.Hum Genet，2011，129（3）:329-334.

［8］Wei S，Zhang TD，Zhou Y，et al.Fine mapping of the disseminated superficial porokeratosis locus to a 2.7 Mb region at 18p11.3［J］.Clin Exp Dermatol，2010，35（6）:664-667.

［9］Xia JH，Yang YF，Deng H，et al.Identification of a locus for disseminated superficial actinic porokeratosis at chromosome 12q23.2-24.1［J］.J Invest Dermatol，2000，114（6）:1071-1074.

［10］Cui H，Li L，Wang W，et al.Exome sequencing identifies SLC17A9 pathogenic gene in two Chinese pedigrees with disseminated superficial actinic porokeratosis［J］.J Medical Genetics，2014，51（10）:699-704.

［11］Zhang Z，Li C，Wu F，et al.Genomic variations of the mevalonate pathway in porokeratosis［J］.Elife，2015，4: e06322.

［12］Zeng K，Zhang QG，Li L，et al.Splicing mutation in MVK is a cause of porokeratosis of Mibelli［J］.Arch Dermatol Res，2014，306（8）:749-755.

［13］Zhou MS，Xie HF，Chen ML，et al.A novel mutation for disseminated superficial actinic porokeratosis in the MVK gene［J］.Br J Dermatol，2014，171（2）:427-429.

（收稿:2016-01-18）

Mutation detection of MVK gene with disseminated superficial actinic porokeratosis

Parimi Leela Rani1，2，FU Xi'an1，2，3，WANG Zhenzhen3，YANG Baoqi3，SHI Zhongxiang3，LIU Hong3，ZHANG Furen1，3.
1.Shandong Provincial Hospital for Skin Diseases，Affiliated to Shandong University，Jinan 250022，China；2. School of Medicine，Shandong University，Jinan250000，China；3.Shandong Provincial Institute of Dermatology and Venereology，Shandong Academy of Medical Sciences，Jinan 250022，China
Corresponding author:Zhang Furen，E-mail:zhangfuren@hotmail.com

Objective:To detect mutations of MVK gene in 2 familial patients with disseminated superficial actinic porokeratosis（DSAP）.Methods:Polymerase chain reaction and direct sequencing were performed in the 2 DSAP families and 100 healthy controls to identify the mutations of MVK gene.Results:One novel splicing mutation（c.1040-2A＞C）and one reported missense mutation（c.1094T＞C）were identified. Conclusion:This study further confirms that MVK is associated with the onset of DSAP，which contributes further to the understanding of the pathogenesis of DSAP.

DSAP；MVK gene；mutations

山东省自然科学基金青年基金（编号:ZR2012HQ031）

1山东省皮肤病医院，山东大学，济南，250022 2山东大学医学院，济南，250000 3山东省皮肤病性病防治研究所，山东省医学科学院，济南，250022

张福仁，E-mail:zhangfuren@hotmail.com

#并列第一作者