计算机辅助高效液相色谱法对食品中7种防腐剂的检测

王　平，陈宁生（1.安徽工程大学生物与化学工程学院，安徽芜湖　241000；2.芜湖市产品质量监督检验所，安徽芜湖　241000）

计算机辅助高效液相色谱法对食品中7种防腐剂的检测

王平1，2，陈宁生1∗
（1.安徽工程大学生物与化学工程学院，安徽芜湖241000；2.芜湖市产品质量监督检验所，安徽芜湖241000）

在计算机辅助下，建立食品中7种防腐剂的高效液相色谱检测方法.食品通过提取，离心，固相萃取净化，计算机辅助高效液相色谱优化分离后，通过二极管阵列检测器进行鉴定，并依据外标法定量.检测器响应值与防腐剂的浓度在一定范围内均有良好的线性关系，且相关系数均在0.999以上.食品中7种防腐剂的回收率在90.4%～93.8%之间，相对标准偏差（n=6）在1.5～6.4%之间.实验结果显示，通过计算机辅助技术缩短了色谱条件的优化时间，显著提高了检测效率，同时由于该方法具有较高的精密度、准确度，因此，可适用于单种或多种防腐剂同时测定.

防腐剂；高效液相色谱；计算机辅助

为了保障食品的安全性及其功能化，GB2760-2014（简称“标准”）［1］明确限定了食品添加剂种类及添加量.但是在食品中超剂量使用防腐剂，甚至是添加一些非法添加剂仍时有发生.目前，食品中防腐剂的检测方法主要有HPLC法［2-5］、GC或GC-MS法［6-9］、毛细管电泳法［10］、离子色谱法［11］等.检测方法大多针对标准中允许的苯甲酸及其钠盐、山梨酸及其钾盐、脱氢乙酸及其钠盐、对羟基苯甲酸酯类及其钠盐、丙酸及其钠（钙）盐等［12］，且只是对指定食品中的一种或几种防腐剂进行检测，不能对食品进行全面的检测，特别对非法添加的防腐剂缺乏有效检测.因此，这些检测方法具有一定的局限性.建立一种能对多种食品中一种或多种防腐剂同时检测的方法就显得尤为重要.

实验选择国家允许使用、易滥用的常见防腐剂（如苯甲酸、2，4-二氯苯氧乙酸（简称24D）、桂醛、联苯醚），禁止作为食品防腐剂的水杨酸、苯甲醇，以及明令禁止使用且危害较大的富马酸二甲酯作为检查对象，利用计算机辅助优化分离条件，建立高效液相色谱—二极管整列检测器对多种食品中7种防腐剂同时且快速检测和方法.

1　实验部分

1.1仪器、试剂与材料

高效液相色谱仪LC-20 A（日本岛津公司）；配有二极管阵列检测器（SPD-M20A）；甲醇为色谱纯（美国TEDIA公司）；标准品分别购自国家标准物质研究中心和中国计量科学研究院；水为实验室用一级水；其余试剂均为分析纯；液相色谱柱、Pro Elut PXA混合型强阴离子交换反相固相萃取柱及其他固相萃取小柱（简称SPE小柱）均购自迪马公司；实验所用食品样品均购自芜湖市场.

1.2试验方法

（1）标样溶液的配制.用甲醇将精准称量的标准物质溶解，并转移至容量瓶中用甲醇定容作为储备液，于4℃下保存备用，使用时制备成混合标准溶液并稀释至所需浓度.

（2）样品处理.准确称取5 g（精确至0.000 1 g）左右样品置于50 m L离心管中，加入20 m L乙醇水溶液（1∶1），40 KHz超声15 min，以500 0 r/min离心10 min，上清液待净化.

（3）净化.依次向ProElut PXA小柱中加入3 m L甲醇、3 m L水，加入5 m L样品溶液，用5 m L水淋洗，3 m L甲酸甲醇水（2∶80∶20）溶液洗脱，收集洗脱液，氮吹至近干，流动相定容至1 m L.

（4）色谱条件.色谱柱：Platisil ODS 5μm 250×4.6 mm；保护柱：EasyGuard Kit C18；流动相：甲醇-0.02 mol/L乙酸铵水溶液梯度洗脱，洗脱程序如表1所示；进样量10μL；流速为1.0 m L/min；柱温为30℃；采用二极管阵列检测器检测.

表1　流动相梯度洗脱程序

（5）定性和定量.根据保留时间及紫外光谱进行定性，用外标峰面积法进行定量.

2　结果与讨论

2.1样品防腐剂提取条件

选择合适的提取溶剂可以提高防腐剂的提取效率和方法的准确度.考虑到研究对象的结构特性，分别采用甲醇、1+1乙醇、正己烷、乙醚作提取溶剂试验.然而试验中发现乙醚、正己烷等可能将食品样品中脂肪等干扰物质带入，同时甲醇极性较大，因此兼顾SPE小柱的性质，选择1+1乙醇水溶液提取.

2.2固相萃取柱的选择

使用混合标样过柱，对比PWA和PXA两种混合型小柱，结果如表2所示.由表2可知，PWA对酸性较强的苯甲酸、水杨酸、24D保留效果欠佳，回收率不足50%；PXA对各组分的保留性和洗脱性都比较理想.因此，选择ProElutPXA混合型强阴离子交换反相固相萃取柱作为实验净化小柱.

表2　固相萃取效率

2.3检测器及检测波长的选择

基于被测的7种物质单标进样都具有较强的紫外吸收，选择二极管阵列作为检测器，扫描得到各物质最大吸收波长如表3所示.考虑检测波长低于210 nm时，检测体系本底响应较大.同时兼顾紫外吸收强度、本底响应和方便检测，因此选定苯甲酸、水杨酸、24D、桂醛、联苯醚检测波长为230 nm，苯甲醇、富马酸二甲酯检测波长为210 nm.

表3　最大吸收波长和检测波长

2.4流动相及温度的选择

比较甲醇-水、甲醇-磷酸盐、甲醇-乙酸铵流动相，发现甲醇水体系中水杨酸、24D无保留；甲醇乙酸铵比甲醇磷酸盐能获得更好的分离效果，所以选择0.02 mol/L乙酸铵+甲醇作为流动相.引入柱温和流动相比例两个因素，分别在30℃、45℃下30 min和60 min内，甲醇相从5%匀速增至95%.分别用标准物质进样得到各组分保留时间和峰面积，借助计算机色谱模拟软件Dry Lab，通过调节梯度曲线和温度模拟分离可得到最佳分离温度30℃和梯度洗脱程序如图1所示.

混合标准物质色谱图如图2所示.计算机模拟色谱分离效果，既可以缩短色谱条件探讨时间，也可以减少试剂消耗，最终降低检测成本.

图1　色谱条件优化结果图

图2　混合标准物质色谱图

2.5标准工作曲线

使用标准物质储备液配制成适当浓度的混合标样，在柱温30℃条件下，按照表1中梯度洗脱程序进样，以保留时间定性，以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制校准曲线，线性拟合得到回归方程和相关系数如表4所示.

表4　防腐剂保留时间、线性范围、线性方程、相关系数（n=6）及检出限

2.6准确度

以绿豆糕为样品做标准添加回收实验，每种物质进行6次平行测定，计算回收率、标准偏差和相对标准偏差，结果如表5所示，加标色谱图如图3所示.

表5　防腐剂的添加回收率及其RSD（n=6）

2.7样品分析

对糕点、酱腌菜、蜜饯、豆制品、调味料、肉制品6大类食品，每类10组样品，共计60组样品的7种防腐剂同时进行检测，每个样品平行试验2次，其中6组蜜饯（分别为0.11 g/kg、0.24 g/kg、0.42 g/kg、0.36 g/kg、0.25 g/kg、0.40 g/kg）、5组酱腌菜（分别为0.33 g/kg、0.43 g/kg、0.54 g/kg、0.13 g/kg、0.35 g/kg）、5组调味品（分别为0.22 g/kg、0.37 g/kg、0.41 g/kg、0.28 g/kg、0.31 g/kg）中有苯甲酸检出，水杨酸、苯甲醇、富马酸二甲酯、24D、桂醛、联苯醚均未检出.同时使用现有的国家标准进行对比检测，所有结果相对误差均小于一般色谱平行样10%的要求，说明检测结果及方法是可靠的.

图3　加标回收色谱图

3　小结

实验方法前处理大为简化，同时实验结果表明，7种防腐剂在色谱柱上分离度较好，实验平行性较佳、回收率较好.检测结果准确、精密度较高，且检测速度快，可对食品中多种防腐剂同时测定.计算机辅助有效地缩短了时间，节约了化学试剂用量，为其他样品的检测提供了可能.

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Computer-aided Determination of Seven Preservatives in Food by HPLC

WANG Ping1，2，CHEN Ning-sheng1∗
（1.College of Biological and Chemical Engineering，Anhui Polytechnic University，Wuhu 241000，China 2.Wuhu Institute of Product Quality Supervision，Wuhu 241000，China）

A HPLC method to determine seven kinds of preservatives in food was established with computer softwares.Preservatives in food were extracted，centrifuged and SPE purified.The sample solutions were optimally separated by HPLC with computer softwares.Preservatives were analyzed by using the qualitative PDA and quantitative external standard methods.Within a certain range，a good linear correlation was found between the response values and preservative concentration.And their correlation coefficients were above 0.999.The recovery ratios of seven kinds of preservatives in food were between 90.4%～93.8%，and their RSD were between 1.5～6.4%.Results showed that the separation efficiency of preservatives was improved.Therefore，the method can be applied to determine single or multiple preservatives due to its high precision and accuracy.

preservatives；high performance liquid chromatographic（HPLC）；computer aid method

TS207

A

1672-2477（2016）04-0068-05

2016-02-22

王平（1986-），男，安徽芜湖人，硕士研究生.

通讯简介：陈宁生（1958-），女，江苏南京人，教授，硕导.