肾小管上皮细胞线粒体氧化损伤在肾间质纤维化中的作用及机制

黄继义　钟鸿斌　逯富华　朱茂述厦门市第五医院肾内科，福建厦门　361000

肾小管上皮细胞线粒体氧化损伤在肾间质纤维化中的作用及机制

黄继义钟鸿斌逯富华朱茂述
厦门市第五医院肾内科，福建厦门361000

目的探讨肾小管上皮细胞线粒体氧化损伤在肾间质纤维化中的作用机制。方法2015年6～12月期间，于本地动物实验中心选取60只健康雄性大鼠，根据处理方法的不同将其分为实验组和对照组，其中实验组行左侧输尿管结扎术，对照组则仅接受左侧输尿管游离，14 d后对两组大鼠的左侧肾脏中线粒体相关基因的表达情况、肾脏功能等参数进行检测分析。结果实验组大鼠术后14 d mtDNA（1.49±0.12）、NRF1（1.87±0.17）、PGC1a （1.76±0.21）、Drp1（2.49±0.24）、Mfn2（2.45±0.27）的表达水平均明显高于对照组（1.07±0.23、1.11±0.29、1.05±0.32、1.14±0.35、1.17±0.14），差异具有统计学意义（P＜0.05）；术后14 d，实验组大鼠肾脏组织中的COX（2.61±0.27）明显高于对照组的（1.07±0.19），SOD较对照组明显降低（0.55±0.16 vs 1.07±0.18），其RIF指数（22.76±1.39）明显高于对照组的（0.81±0.16），差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论在肾间质纤维化中肾小管上皮细胞线粒体氧化损伤发挥着十分重要的作用，缺氧所造成的线粒体氧化损伤会造成肾小管功能受损，引起大量致纤维因子的产生，并从多途径引起肾间质纤维化。

肾间质纤维化；肾小管上皮细胞；线粒体氧化损伤；肾小管功能

［Abstract］Objective To discuss the effect andmechanism ofmitochondria oxidative damage in renal tubular epithelial cells on renal interstitial fibrosis.M ethods A total of 60 healthmale ratswere selected from a local animal experimental center from June to December 2015 and divided into study group and control group.Rats in the study group were given left ureteral obstruction，while those in the control group were only given left ureteralmobilization.Parameters including the expression of genes in mitochondria and renal function of the left kidney were detected and analyzed after 14 days.Results At 14 d after surgery，the expression levels ofmtDNA（1.49±0.12），regenerating gene（1.87±0.17），interrupted gene（1.76±0.21），and fusion gene（2.49±0.24，2.45±0.27）in the study group were all significantly higher than those（1.07±0.23，1.11±0.29，1.05±0.32，1.14±0.35，and 1.17±0.14）in the control group（P＜0.05）.The level of COX （2.61±0.27）in kidney tissues in the study group was significantly higher than that（1.07±0.19）in the control group，while the level of SOD was significantly lower than the control group（0.55±0.16 vs 1.07±0.18）.The RIF index（22.76± 1.39）in the study group was significantly higher than that（0.81±0.16）in the control group（P＜0.05）.Conclusion Mitochondria oxidative damage in renal tubular epithelial cells has a significant effect on renal interstitial fibrosis.Mitochondria oxidative damage caused by anoxia may lead to functional impairment of kidney tubules，inducing a large number of fibrosis factors and resulting in renal interstitial fibrosis from multiple pathways.

［Key words］Renal interstitial fibrosis；Renal tubular epithelial cell；Mitochondria oxidative damage；Renal tubular function

绝大部分慢性肾脏疾病均存在肾间质纤维化表现，如间质细胞外基质和小管基底膜成分出现定量及定性改变、肌纤维母细胞聚集、肾小管萎缩等［1］。目前大量研究均指出，在肾小管基膜破坏过程中，患者多存在肾小管上皮细胞转化为肌纤维母细胞样细胞现象，继而引起间质区出现大量细胞外基质（engine controlmodule，ECM）沉积，引发肾小管萎缩，最终造成间质纤维化病损［2，3］。本次研究在2015年6～12月期间通过建立大鼠模型，旨在探讨肾小管上皮细胞线粒体氧化损伤在肾间质纤维化中的作用机制。现报道如下。

1　资料与方法

1.1一般资料

选取21日龄SD雄性成年大鼠60只，由本地动物实验中心提供，实验动物生产许可证号为SCXK2015-0002。将其随机分为对照组和实验组，实验组大鼠30只，平均体重（221.9±12.4）g，对照组大鼠30只，平均体重（216.7±13.5）g，两组大鼠的日龄、体重等一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05）。其中对照组接受左侧输尿管游离，实验组大鼠接受左侧输尿管结扎术。

1.2方法

1.2.1模型制备方法 实验组：取10%水合氯醛（0.03 mL/kg）对大鼠行腹腔注射麻醉，在手术台上对其行右侧卧位固定，剪除体毛后对手术区进行消毒，取左侧腹切口，将皮肤、肌肉和腹壁各层逐层切开，使左侧输尿管暴露并对其进行分离，使用5-0丝线对其进行结扎并离断输尿管，逐层缝合完成手术。对照组大鼠仅对左侧输尿管进行游离，但不进行结扎和离断。

1.2.2检测方法术后14 d摘取两组大鼠左侧肾脏，并对其进行处理，对下述指标进行检测：①线粒体基因表达水平：采用Real-time PCR技术度两组大鼠肾小管上皮细胞线粒体NRF1、PGC1a、Drp1、Mfn2和mtDNA（mitochondrial DNA，mtDNA）的表达水平进行检测记录；②超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、环氧酶（cyclo-oxygenase，COX）水平：采用Real-time PCR技术对两组大鼠肾脏组织中的SOD和COX水平进行检测；③肾间质纤维化（renal interstitial fibrosis，RIF）指数：对大鼠肾脏组织进行Masson染色，其中胶原纤维呈绿色，对其中绿色数量进行统计；④对两组大鼠的肾组织羟脯氨酸（hydroxyproline，Hyp）含量进行比较。

1.3统计学方法

采用统计学软件SPSS18.0进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间结果比较进行t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2　结果

2.1两组大鼠线粒体基因表达水平比较

实验组大鼠术后14 d mtDNA（1.49±0.12）、NRF1 （1.87±0.17）、PGC1a（1.76±0.21）、Drp1（2.49±0.24）、Mfn2 （2.45±0.27）的表达水平均明显高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05），提示实验组大鼠肾脏组织中的线粒体具有较高活性。见表1。

2.2两组大鼠术后14 d肾脏指标比较

术后14 d，实验组大鼠肾脏组织中的COX明显高于对照组，SOD较对照组明显降低，其RIF指数明显高于对照组，且实验组大鼠肾体比、肾脏Hyp含量均明显高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表1　两组大鼠线粒体基因表达水平比较（±s）

表1　两组大鼠线粒体基因表达水平比较（±s）

?

表2　两组大鼠术后14 d肾脏指标比较（±s）

表2　两组大鼠术后14 d肾脏指标比较（±s）

COX　SOD　RIF指数　Hyp （μg/g）肾体比（mg/g）组别　n实验组对照组t值P值30 30 2.61±0.27 1.07±0.19 25.549 0.000 0.55±0.16 1.07±0.18 -11.826 0.000 22.76±1.39 0.81±0.16 80.227 0.000 481.79±25.40 411.54±31.75 9.463 0.000 10.71±0.37 7.49±0.42 31.509 0.000

3　讨论

慢性肾脏疾病已成为严重威胁公众健康的常见慢性疾病，此种患者多以肾纤维化作为病理基础。Huising MO等［4］研究证实，在肾纤维化早期可采取有效措施促进其逆转，特别是对于肾间质和肾小管而言，其具有自我修复功能，在一定程度上可促进肾间质纤维化的逆转。

肾间质纤维化作为多种慢性肾脏疾病的终末期病例特点，在肾脏结构破坏过程中具有十分重要的作用，会造成间质毛细血管破坏、肾小管萎缩、成纤细胞增生和肾间质中细胞外基质的积聚［5-7］。相关资料显示，肾间质纤维化主要从以下四个方面实现：细胞损伤及活化、促炎因子和致纤维化因子产生、纤维化形成、肾脏结构和功能丧失，在此过程中，肾小管上皮细胞损伤和功能不全占据着十分关键的位置［8，9］。临床研究证实，缺氧性损伤会造成肾小管上皮细胞损伤，主要由于肾小管上皮细胞具有高溶转运活性特征，对于线粒体能量供给具有较高要求，缺氧会造成线粒体氧自由基产生增多，与线粒体膜结合造成其通透性改变［10-13］。从而引起细胞色素C由线粒体进入细胞浆，引发细胞损伤途径。左侧输尿管结扎会造成肾脏组织出现血流动力学改变，引起组织发生缺氧缺血性损伤，从而导致肾间质纤维化的发生［14］。

在本研究中，通过对大鼠左侧输尿管进行结扎以模拟肾小管上皮细胞线粒体氧化损伤，通过对两组小鼠肾脏组织中线粒体的基因表达情况进行检测，结果显示实验组大鼠的mtDNA、NRF1、PGC1a、Drp1、Mfn2表达水平均明显高于对照组（P＜0.05），提示在实验组大鼠中存在显著的肾脏线粒体活性增强表现，表明模型建立成功。

肾间质纤维化的形成机制较为复杂，以ECM积聚和肾间质纤维细胞增生为主要病理特征。SOD、COX作为表征肾小管上皮细胞活性的主要指标，在发生肾小管损伤时，COX和SOD水平会出现相应变化。在本研究中，术后14 d实验组大鼠的SOD水平明显低于对照组，COX则明显高于对照组（P＜0.05），表明实验组大鼠存在十分显著的肾小管上皮细胞损伤，结合线粒体基因表达情况，提示缺氧所造成的线粒体氧化损伤同肾小管上皮细胞损伤之间存在密切联系。其中，氧化损伤所引起的肾小管上皮细胞损伤会造成大量致纤维因子的产生，引起ECM产生和降解失衡，从而在肾间质中出现大量ECM沉积，造成患者肾小管萎缩和肾功能减退。在众多致纤维化因子中，以TGF-β1作用最为显著。Jelakovic B等［15］研究指出，肾间质中的TGF-β1因子主要来源于肌纤维母细胞和成纤维细胞，在本次研究中，肾脏组织Masson染色试验证实，在实验组大鼠中存在明显肾间质纤维化表现，再次证实缺氧损伤会诱发肾间质纤维化。同时对两组大鼠的肾脏发育情况进行分析显示，实验组大鼠的肾体比、肾脏Hyp含量均明显高于对照组（P＜0.05），与相关报道中的结论基本一致。

综上所述，本次研究从肾小管上皮细胞线粒体氧化损伤研究入手，对肾小管解离在肾间质纤维化中的作用进行分析，创新性从线粒体动力平衡、功能等方面对线粒体损伤同TGF-β1致纤维因子之间的关系进行探讨。在肾间质纤维化中肾小管上皮细胞线粒体氧化损伤发挥着十分重要的作用，缺氧所造成的线粒体氧化损伤会造成肾小管功能受损，引起大量致纤维因子的产生，并从多途径引起肾间质的纤维化。

［1］王磊，刘修恒，陈志远，等.臭氧氧化预处理对体外大鼠肾小管上皮细胞缺血再灌注损伤的保护作用［J］.中华实验外科杂志，2014，31（6）：1207-1209.

［2］周波，宋立群，贠捷，等.真武汤对UUO模型大鼠肾小管损伤和肾间质纤维化影响的研究［J］.中医药学报，2014，42（3）：136-138.

［3］高文波，魏军军，翁国斌，等.移植肾间质纤维化和小管萎缩与肾小管上皮间充质转化的关系［J］.实用医学杂志，2013，29（7）：1083-1086.

［4］Huising MO，Van der Aa LM，Metz JR，etal.Corticotropinreleasing factor（CRF）and CRF-binding protein expression in and release from the head kidney of common carp：Evolutionary conservation of the adrenal CRF system［J］.J Endocrinol，2007，193（3）：349-357.

［5］黄昭，陈伟明，于晓春，等.大鼠脂肪源性干细胞PDE5基因沉默对肾小管上皮细胞缺血-复氧损伤的保护作用［J］.中华肾脏病杂志，2015，31（9）：693-700.

［6］付强，王惠明，颜奇，等.支架蛋白JLP在单侧输尿管梗阻小鼠肾间质纤维化中的作用及其机制探讨［J］.中华肾脏病杂志，2016，32（1）：30-36.

［7］唐琳，易润，杨冰，等.缬沙坦对糖尿病肾病大鼠肾间质纤维化的作用［J］.中华肾脏病杂志，2012，28（8）：633-638.

［8］李文，吴红赤，封宝红，等.线粒体功能障碍在尿酸损伤肾小管上皮细胞中的作用［J］.中国中西医结合肾病杂志，2015，16（3）：200-202.

［9］张翠薇，谢茂，张旭，等.威灵仙对单侧输尿管梗阻模型大鼠血液流变学及肾间质纤维化的影响［J］.实用医学杂志，2012，28（18）：3022-3024.

［10］黄继义，林鹰，逯富华，等.肾小管上皮细胞线粒体氧化损伤在肾间质纤维化中的病理学机制研究［J］.北方药学，2016，13（1）：103-105.

［11］倪佳佳，郭燕，杨玲云，等.microRNA-709负性调控线粒体功能参与肾小管上皮细胞损伤［J］.中华实用儿科临床杂志，2015，30（9）：711-714.

［12］孔翠文，闫慧，李靖，等.缬沙坦对尿酸性肾病大鼠肾间质纤维化的干预机制研究［J］.中国全科医学，2013，16（6）：644-648.

［13］谢敏，周建华，朱国琴.肾间质纤维化大鼠管周毛细血管病变的实验观察［J］.临床儿科杂志，2012，30（11）：1054-1057.

［14］王刘伟，董吉，房豫东，等.肾损伤分子1对高糖诱导大鼠肾小管上皮细胞表达单核细胞趋化蛋白1和纤维连接蛋白的影响［J］.中华肾脏病杂志，2014，30（1）：48-52.

［15］Jelakovic B，Castells X，Tomic K，et al.Renal cell carcinomas of chronic kidney disease patients harbor themutational signature of carcinogenic aristolochic acid［J］.Int JCancer，2015，136（12）：2967-2972.

Effect and mechanism of m itochondria oxidative damage in renal tubular epithelial cells on renal interstitial fibrosis

HUANG Jiyi ZHONG HongbinLU Fuhua ZHU Maoshu
Department of Nephrology，Xiamen Fifth Hospital，Xiamen361000，China

R692

A

1673-9701（2016）20-0032-03

福建省厦门市科技惠民项目（3502Z20144068）

2016-05-06）