miR-126对急性心肌梗死大鼠心肌细胞凋亡的影响

高　威，钟　锋

(华中科技大学同济医学院附属普爱医院心胸外科，武汉　430030)



miR-126对急性心肌梗死大鼠心肌细胞凋亡的影响

高威，钟锋*

(华中科技大学同济医学院附属普爱医院心胸外科，武汉430030)

目的探讨miR-126对急性心肌梗死(AMI)大鼠心肌细胞凋亡的影响。方法通过冠状动脉左前降支结扎大鼠建立AMI模型，随机分为AMI组、miR-126 mimics negative control (NC)组及miR-126组，其中NC组及miR-126组分别采用心肌组织局部注射慢病毒转染miR-126 mimics NC及miR-126 mimics，另外假手术组采用冠状动脉左前降支穿线不结扎。记录大鼠心脏功能，TCC法及原位末端凋亡法(TUNEL)检测心肌凋亡指数及梗死面积，比色法检测天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase 3)及Caspase 8活性，Western-blot法检测Bax及Bcl-2表达，同时RT-PCR法检测Fas及Fas-L mRNA表达。结果与假手术组比较，AMI组及NC组左室射血分数(LVEF)及左室长轴缩短分数(FS)升高，左室舒张末期内径(LVDd)及左室收缩末期内径(LVDs)降低，心肌凋亡指数提高，心肌梗死面积增大，Caspase 3及Caspase 8活性上升，Bax蛋白表达量上调，Bcl-2蛋白表达量下调，Fas及Fas-L mRNA水平上升，差异具有统计学意义(P< 0.01)。与AMI组及NC组比较，miR-126组能扭转此变化，差异具有统计学意义(P< 0.01)。结论miR-126能显著抑制AMI大鼠心肌细胞凋亡，与调节细胞凋亡相关蛋白表达有关。

miR-126；急性心肌梗死(AMI)；细胞凋亡

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是临床常见冠心病的一种，主要表现为心肌极度缺血，使得急性血栓从而导致了血管闭塞。近年来其发病率显著上升，目前因AMI死亡人数占全球死于心血管疾病中人数的一半，是危害人类死亡的头号杀手[1]。AMI起病急骤，病情变化迅速，在大多数老年人中心肌梗死容易导致心肌重构，最终导致心力衰竭。目前研究显示，在心肌梗死早期，心肌细胞凋亡在心梗后所引起的心室重构及心力衰竭中起重要作用，通过阻断AMI心肌梗死对于抑制心梗后心肌损伤具有重要意义[2-4]。miRNAs是一类进化上高度保守的非编码小分子RNA，以往对其研究主要集中于机体发育的调控及肿瘤形成中，近些年研究陆续发现有数十种miRNA能特异性表达于心肌细胞，并与心肌肥大，心肌重塑，心力衰竭，心肌缺血再灌注，心肌梗死等心血管疾病过程密切相关[5-6]。如Fichtlscherer等[7]发现AMI患者心肌来源miRNAs中包括miR-126表达量下调，此观点也陆续被Long等[8]，Hsu等[9]证实。上述报道说明miR-126在AMI患者中低表达，并与AMI的发生发展密切相关。此外研究也表明miR-126是一种内皮特异性miRNA，在内皮细胞中表达丰富，同时过表达的miR-126对于AMI动物的血管再生具有显著促进作用，从而修复心肌梗死损伤[10-11]。而过表达miR-126是否可以通过抑制心肌细胞凋亡从而抑制心肌细胞凋亡尚未见报道，因而本实验通过构建AMI大鼠心肌模型，并通过慢病毒转染局部心肌组织注射miR-126，从而探讨miR-126过表达对于AMI大鼠心肌细胞凋亡的作用及相关机制。

1　材料和方法

1.1实验动物

SD清洁级雄性大鼠52只，2月龄，体重(180～220)g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司[SCXK(沪)2012-0002]。所有大鼠均在华中科技大学同济医学院[SYXK(鄂)2013—0044]的清洁环境下饲养观察，室内温度控制在(21～ 25) °C，大鼠自由饮食和摄水。并按实验动物3R原则给予人道的关怀。

1.2试剂及仪器

兔抗Bax及Bcl-2单克隆抗体购自美国Eptimics公司；Caspase 3、Caspase 8活性检测试剂盒，BCA试剂盒购，小鼠抗GAPDH单克隆抗体自碧云天生物技术有限公司；TUNEL检测试剂盒购自武汉博士德生物技术有限公司；miR-126 mimics及miR-126 mimics negative control(NC)由广州市锐博生物科技有限公司订购合成。迷你双垂直电泳仪，迷你转印电泳仪，ChemiDocTM XRS凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司；PHILIPS ATL-HDI5000多普勒心脏彩超仪购自美国ATL公司；Tecan Infinite F200/M200型多功能酶标仪购自瑞士TECAN集团公司。

1.3AMI模型建立与分组给药[3, 12]

40只大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，剔除大鼠颈部和胸部毛发并碘伏消毒颈部皮肤，做切口1 cm，暴露颈部气管，连接呼吸机。调整呼吸机参数为呼吸频率为120次/min，潮气量为7～8 mL，呼吸时间比为1∶2。胸部皮肤碘伏消毒后，以胸部左侧第4根肋骨为手术切口，逐层剥离皮肤，使心脏充分暴露，在左心耳与肺动脉圆锥之间找到冠状动脉左前降支，并结扎，当观察到心电图记录仪上ST段背向上抬高，心律较为缓慢，同时左心室变白，说明AMI制作成功，最终AMI制作成功并存活大鼠36只，即随机分为AMI组，NC组，miR-126组，每组12只。而假手术组冠状动脉左前降支仅仅穿线但不结扎(12只)。其中NC组：携带GFP的慢病毒空载体(miR-126 mimics NC)以4×107病毒数量进行心肌组织局部注射转染，miR-126组：携带miR-126 mimics慢病毒以4×107病毒数量进行心肌组织局部注射转染，而AMI组与假手术组每天给予等量生理盐水。于第7天处死大鼠，并将心肌组织置于-80℃冰箱待测。

1.4心脏功能检测

大鼠治疗2周后，腹腔注射10%水合氯醛进行麻醉，进而对大鼠行心脏彩超检查，并记录相关指标：左室射血分数(LVEF)，左室长轴缩短分数(FS)，左室舒张末期内径(LVDd)，左室收缩末期内径(LVDs)。

1.5心肌梗死面积的测量

沿着心脏横轴方向在心尖到结扎点间进行切片，每片1 mm，后经1%TCC进行染色，正常心肌染成红色，AMI导致的缺血心肌染成白色。拍照后经IMAGE PRO图像分析，并计算得到心肌梗死面积占左心室的百分数。

1.6TUNEL法检测心肌细胞凋亡

采用TUNEL试剂盒检测心肌组织凋亡，严格按照试剂盒说明书进行操作，在200倍光镜下随机选取5个视野进行观察，阳性细胞被染成棕黄色，凋亡细胞数与总细胞数的比值，并以百分比记做细胞凋亡指数。

1.7Caspase 3及Caspase 9活性检测

按照Caspase 3及Caspase 9活性检测试剂盒说明书进行操作，于酶标仪405 nm处检测Caspase活性。

1.8Western-blot检测心肌组织中Bax及Bcl-2蛋白表达

取各组心肌标本，用匀浆器处理后，加入适量的RIPA裂解液裂解，获得总蛋白。采用BCA试剂盒测定蛋白浓度。蛋白变性，上样，进行SDS凝胶电泳，后湿法转膜。在一抗溶液(Bcl-2及Bax，稀释浓度为1∶100)4℃过夜孵育；次日二抗溶液中室温孵育1～2 h。滴加曝光液，在凝胶成像系统中曝光。用“Quantity one”软件统计各抗体条带灰度值。

1.9RT-PCR检测检测心肌组织中Fas及Fas-L mRNA表达

参考trizol试剂盒说明书提取心肌组织中总RNA，接着紫外分光光度计检测RNA纯度。进一步采用一步法RT-PCR试剂盒将RNA逆转录成cDNA，并扩增，扩增产物用于2%的琼脂糖胶电泳。反应体系为：变性95℃，15 s，退火60℃，20 s，延伸70℃，60 s，共36个循环。引物如下。miR-126上游引物：5’- GGCTTCGTACCGTGAGTAAT-3’，下游引物：5’- GTGCAGGGTCCGAGGT-3’，长度145 bp，Fas上游引物：5’- GTGAAACCGACAAC AACTGCT-3’，下游引物：5’- CAAGGCTCAAGG ATGTCTTCA-3’， 长度349 bp； Fas-L上游引物：5’- ATAGAGCTGTG GCTACCGGT-3’，下游引物：5’- CTCCAGAGATCA AAGCAGTTCC-3’， 长度285 bp；GAPDH上游引物：5’-GCTTCGGCAG CACATATAC TAAAAT-3’，下游引物：5’-CGCTTCACGAATTTG CGTGTCAT-3’，长度314 bp(基因由上海生工生物工程有限公司合成)。

1.10统计学分析

2　结果

2.1各组大鼠心肌组织中miR-126的表达

与假手术组比较，AMI组及NC组中miR-126表达量显著降低，差异均具有统计学意义(P< 0.01)；与AMI组及NC组比较，miR-126组中miR-126表达量显著提高，差异具有统计学意义(P< 0.01)。见图1。

注：与假手术组比较，**P < 0.01；与AMI组及NC组比较，##P < 0.01。图1　各组大鼠心肌组织中miR-126的表达Note. Compared with sham operation group, **P < 0.01; Compared with AMI group and NC group, ##P < 0.01.Fig.1　Expression of miR-126 in each group

2.2miR-126对AMI大鼠心脏功能的影响

与假手术组比较，AMI及NC组中LVEF及FS明显降低，LVDd及LVDs明显提高，差异均具有统计学意义(P< 0.01)；与AMI组及NC组比较，miR-126组中LVEF及FS明显提高，LVDd及LVDs明显降低，差异均具有统计学意义(P< 0.01)。见表1。

2.3miR-126对AMI大鼠心肌凋亡指数及梗死面积的影响

与假手术组比较，AMI组及NC组中心肌凋亡指数提高，梗死面积增加，差异均具有统计学意义(P<0.01)；与AMI组及NC组比较，miR-126组中心肌凋亡指数显著降低，梗死面积减少，差异均具有统计学意义(P<0.01)，见图2，表2。

表1　miR-126对AMI大鼠心脏功能的影响

注：与假手术组比较，**P< 0.01；与AMI组及NC组比较，##P< 0.01。

Note. Compared with sham operation group,**P< 0.01; Compared with AMI group and NC group,##P< 0.01.

表2　miR-126对AMI大鼠心肌凋亡指数及梗死面积的影响(×20)

注：与假手术组比较，**P< 0.01；与AMI组及NC组比较，##P< 0.01。

Note. Compared with sham operation group,**P< 0.01; Compared with AMI group and NC group,##P< 0.01.

2.4miR-126对AMI大鼠心肌组织中Bax及Bcl-2蛋白表达量的影响

与假手术组比较，AMI组及NC组中心肌组织中Bax表达量上调，Bcl-2表达量下调，差异均具有统计学意义(P< 0.01)；与AMI组及NC组比较，miR-126组心肌组织中Bax表达量下调，Bcl-2表达量上调，见图3。

2.5miR-126对AMI大鼠心肌组织中Fas及Fas-L mRNA水平的影响

与假手术组比较，AMI组及NC组中心肌组织中Fas及Fas-L mRNA水平提高，差异均具有统计学意义(P< 0.01)；与AMI组及NC组比较，miR-126组心肌组织中Fas及Fas-L mRNA水平降低，差异均具有统计学意义(P< 0.01)。见图4。

2.6miR-126对AMI大鼠心肌组织中Caspase 3及Caspase 8活性的影响

与假手术组比较，AMI组及NC组中心肌组织中Caspase 3及Caspase 8活性提高，差异均具有统计学意义(P< 0.01)；与AMI组及NC组比较，miR-126组心肌组织中Caspase 3及Caspase 8活性降低，差异均具有统计学意义(P< 0.01)。见表3。

表3　miR-126对AMI大鼠心肌组织中Caspase 3及Caspase 8活性的影响

注：与假手术组比较，**P< 0.01；与AMI组及NC组比较，##P< 0.01。

Note. Compared with sham operation group,**P< 0.01; Compared with AMI group and NC group,##P< 0.01.

注：(A)假手术组；(B)AMI组；(C)NC组；(D)miR-126组。图2　miR-126对AMI大鼠心肌凋亡指数及梗死面积的影响(×20)Note.(A)sham operation group;(B)AMI group;(C)NC group;(D)miR-126 group.Fig.2　Effect of miR-126 on apoptosis index and myocardial infarction area in rats with AMI(×20)

注：(A)Bax及Bcl-2蛋白表达图谱；(B)Bax及Bcl-2蛋白表达分析图。与假手术组比较，**P < 0.01；与AMI组及NC组比较，##P < 0.01。图3　miR-126对AMI大鼠心肌组织中Bax及Bcl-2蛋白表达量的影响Note.(A)Bax and Bcl-2 protein expression profiles;(B)Expression analysis of Bax and Bcl-2 protein.Compared with sham operation group, **P < 0.01; Compared with AMI group and NC group, ##P < 0.01.Fig.3　Effect of miR-126 on the expression of Bax and Bcl-2 in myocardial tissue of rats with AMI

注：(A)Fas及Fas-L mRNA表达图谱；(B)Fas及Fas-L mRNA表达分析图。与假手术组比较，**P < 0.01；与AMI组及NC组比较，##P < 0.01。图4　miR-126对AMI大鼠心肌组织中Fas及Fas-L mRNA水平的影响Note.(A)Fas and Fas-L mRNA expression profiles;(B)Expression analysis of Fas and Fas-L mRNA.Compared with sham operation group, **P < 0.01; Compared with AMI group and NC group, ##P < 0.01.Fig.4　Effect of miR-126 on the expression of Fas and Fas-L in myocardial tissue of rats with AMI

3　讨论

miRNAs是一类长度约为18～25 nt高度保守的小RNA，能结合于其靶基因3’-UTR区域，进而抑制靶基因的翻译，从而参与细胞生长，增值，分化与凋亡的调控。近些年研究发现miRNAs与心肌梗死，心力衰竭，心脏重构，心肌缺血再灌注等心血管疾病的发生发展密切相关。miR-126 不仅是心肌特异性miRNA，也广泛表达于肺脏、心脏及肝脏等血管高度丰富的组织中[11]。Hsu等[9]证实ST段抬高性心肌梗死患者血清中有12个miRNA表达量上调，13个miRNA表达量下调，其中包括miR-126，miR-26a，miR-191等miRNA。Long等[8]采用ELISA法也证实AMI患者血清中miR-126表达量下调。Fichtlscherer等[7]发现AMI患者心肌来源miRNAs中包括miR-126表达量下调。上述研究充分说明了miR-126在AMI患者中低表达，并与AMI的发生发展密切相关。此外Huang等[10]发现过表达miR-126的骨髓干细胞能恢复AMI雌性C57BL/6小鼠心肌梗死血流，增加微血管密度，促进未成熟血管增生。Wang等[13]研究表明过表达miR-126能通过提高VEGF等血管生长因子表达，抑制Spred-1表达而促进血管生成，若敲除miR-126基因，新生小鼠血管增生及迁移受到限制。进而说明了miR-126对于AMI动物心肌梗死具有修复作用，不过是通过促进血管增生。而心肌细胞凋亡对于心梗后心肌重塑，心肌重构及心力衰竭等病理生理过程具有重要作用，因此本研究将探讨过表达miR-126对于AMI大鼠心肌细胞凋亡的影响及具体机制。

所以，本研究在此基础上，首先采用冠状动脉左前降支结扎构建AMI模型，通过检测大鼠心肌功能，证实有36只AMI大鼠构建成功并存活，成功率达90%。接着通过参考相关文献及预实验[3, 10]，通过心肌组织局部注射慢病毒转染miR-126 mimics NC及miR-126 mimics，结果发现AMI组及NC组心肌组织中miR-126表达量显著低于假手术组，与李国达等[14]研究结果一致，而miR-126组较AMI组及NC组心肌组织中miR-126表达量上调。所以本研究接下来探讨过表达miR-126对于AMI心肌细胞凋亡的影响，首先通过检测心脏功能miR-126对AMI大鼠心肌功能的改善作用，结果表明过表达miR-126能显著提高LVEF及FS，降低LVDd及LVDs，从而说明miR-126能通过改善大鼠心脏功能，进而抑制AMI损伤。接着通过TUNEL法及TCC法检测心肌凋亡指数及心肌梗死面积，结果表明过表达miR-126能显著的降低AMI大鼠心肌凋亡指数及心肌梗死面积，说明过表达miR-126能通过抵抗心肌细胞凋亡从而抑制大鼠AMI损伤。

细胞凋亡是一类由基因控制的程序性死亡方式，主要由内源性途径及外源性途径介导，其中外源性途径由细胞表面死亡受体Fas所介导，Fas/Fas-L系统能直接启动凋亡信号，进而结合于Fas相关死亡区域(FADD)，使FADD激活，并与Caspase 8激活，进而介导Caspase级联反应，最终将凋亡信号传递给凋亡执行者Caspase 3，从而使DNA降解断裂，细胞凋亡。研究已经证实AMI大鼠心肌组织中凋亡指数提高的同时伴随着Fas及Fas-L mRNA水平及蛋白表达量显著上调[2, 8]。Caspase 3及Caspase 8在AMI大鼠心肌梗死区活性或蛋白表达量显著提高，当抑制Caspase 3及Caspase 8活性或下调其表达都能使心肌细胞凋亡受到抑制[15-16]。所以本研究通过RT-PCR及比色法分别检测了AMI大鼠心肌组织中Fas、Fas-L mRNA水平及Caspase 3及Caspase 8活性，结果表明AMI组心肌组织中Fas、Fas-L mRNA水平及Caspase 3及Caspase 8活性显著提高，而miR-126组Fas、Fas-L mRNA水平及Caspase 3及Caspase 8活性显著降低，说明过表达miR-126能通过Fas/Fas-L介导的信号途径从而抑制心肌细胞凋亡。而细胞凋亡还受Bcl-2家族蛋白的调控，抑凋亡蛋白Bcl-2能与促凋亡蛋白Bax结合形成异二聚体，或者Bax自身形成寡聚体，从而将凋亡信号传递给Caspase 3，使其发挥凋亡执行作用。研究表明AMI大鼠心肌组织中Bax表达量上调，而Bcl-2表达量下调，通过遏制此变化，能显著的抑制心肌细胞凋亡[15-16]。所以本研究继续探讨各组心肌组织中Bax及Bcl-2表达，结果表明过表达miR-126能上调Bcl-2表达，下调Bax表达，从而抑制心肌细胞凋亡。

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Effect of miR-126 on apoptosis of myocardial cells in rats with acute myocardial infarction

GAO Wei， ZHONG Feng*

(Department of Cardiothoracis Surgery, Puai Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China)

ObjectiveTo explore effect of miR-126 on apoptosis of myocardial cells in rats with acute myocardial infarction (AMI). Methods AMI model was established by ligation of left anterior descending branch of coronary artery. The survivors were randomly divided into 3 groups:AMI group, NC group and miR-126 group. the NC group and miR-126 group were injection of lentiviral transfection of miR-126 mimics NC and miR-126 mimics. The sham operation group was left anterior descending coronary artery without ligation. The rats’ cardiac function was recorded. Apoptosis index and infarct size of myocardium was detected by TCC method and in situ end method (TUNEL), respectively. The activity of cysteinyl aspartate specific proteinase 3 (Caspase 3) and Caspase 8 were determinated by colorimetry. The expression of Bcl-2, Bax was assayed by Western-blot. The expression of Fas and Fas-L mRNA was detected by RT-PCR. ResultsCompared with sham operation group, left ventricular ejection fraction (LVEF) and left ventricular long axis shortening fraction (FS) was increased, left ventricular end diastolic diameter (LVDd) and left ventricular end systolic diameter (LVDs) was decreased, apoptosis index was increased, myocardial infarction area increased, the activity of Caspase 3 and Caspase 8 was increased, the expression of Bax protein was upregulated, the expression of Bcl-2 protein was downregulated, the expression of Fas and Fas-L mRNA was increased in AMI and NC group, the difference was statistically significant (P< 0.01). Compared with AMI and NC group, miR-126 could reverse the change, the difference was statistically significant (P< 0.01). Conclusions miR-126 could inhibit apoptosis of myocardial cells in rats with AMI, which related to regulation of expression of cell apoptotic related protein.

MiR-126; Acute myocardial infarction (AMI); Cell apoptosis

高威(1981-)男，硕士生，住院医师，研究方向：心胸外科疾病的基础与临床。E-mail：gw_0504@163.com。

钟锋(1968-)男，本科，副主任医师，研究方向：心胸外科疾病的基础研究及外科治疗。E-mail:zhongfeng871586@163.com。

研究报告

R-332

A

1671-7856(2016)07-0057-07

10.3969.j.issn.1671-7856.2016.07.010

2016-04-06