bcl-2 基因修饰神经干细胞移植修复大鼠脊髓损伤

张　梅，王跃新*，侯晓华，洪　军，殷胜春，李　岩，刘庆阳

(1.唐山市工人医院，河北 唐山　063000；2. 煤炭总医院，北京　100028)



bcl-2 基因修饰神经干细胞移植修复大鼠脊髓损伤

张梅1，王跃新1*，侯晓华1，洪军1，殷胜春1，李岩1，刘庆阳2

(1.唐山市工人医院，河北 唐山063000；2. 煤炭总医院，北京100028)

目的探讨bcl-2 基因修饰神经干细胞移植对脊髓损伤大鼠损伤神经功能恢复的影响。方法体外培养大鼠神经干细胞， 经Ad-EGFP为载体介导端B淋巴细胞瘤-2基因(bcl-2)基因转染神经干细胞，分为3组：对照组、阴性转染组、bcl-2转染组。Western-blot检测神经干细胞在转染前后bcl-2蛋白的表达。成年雌性SD大鼠85只，造模成功72只,随机分为对照组，NSCs组，bcl-2-NSCs组, 24只/组，按照改良的Allen打击法建立大鼠急性脊髓损伤模型。通过BBB评分、斜板试验进行运动功能评定。造模后7 d通过RT-PCR及Western-blot检测检测脊髓损伤区周围HSP27、c-fos基因的表达，TUNEL法检测细胞凋亡情况。造模后4周取材行病理切片HE染色及荧光显微镜观测EGFP标记的NSC存活及分布情况，通过SEP和MEP观察大鼠神经电生理恢复情况。结果bcl-2基因转染大鼠神经干细胞后，bcl-2转染组与对照组、阴性转染组相比bcl-2基因和蛋白水平均有表达(P< 0.05)；大鼠下肢运动功能评价bcl-2-NSCs组优于NSCs组，NSCs组优于对照组。造模后72 h，bcl-2-NSCs组细胞凋亡数均明显低于对照组和NSCs组(P< 0.05)。造模后7 d，与对照组和NSCs组相比，bcl-2-NSCs组HSP27基因和蛋白的表达均较显著升高(P< 0.05)，bcl-2-NSCs组c-fos基因和蛋白的表达较显著降低(P< 0.05)。造模后4周，HE染色对照组可见脊髓组织缺失及脊髓空洞形成，无神经轴索通过。NSCs组损伤区可见少量神经轴索样结构，脊髓空洞较小，bcl-2-NSCs组可见较多神经轴索样结构，未见脊髓空洞。EGFP标记的阳性细胞数：bcl-2-NSCs组最多，NSCs组次之，对照组未见，且各组之间差异有显著性(P< 0.05)。造模后4周，SEP和MEP的潜伏期：bcl-2-NSCs组NSCs组>对照组，且各组之间差异有显著性意义(P< 0.05)。结论通过Ad-EGFP为载体介导端B淋巴细胞瘤-2基因(bcl-2)基因转染使神经干细胞能够促进体外培养的大鼠神经干细胞增殖。 bcl-2 基因修饰神经干细胞移植可促进脊髓损伤大鼠神经突触的再生，升高脊髓损伤区HSP27表达，降低脊髓损伤区bcl-2基因的表达和神经细胞凋亡，改善大鼠的肢体运动功能和电生理功能。

脊髓损伤；bcl-2 基因；修饰；神经干细胞；移植；修复；大鼠；神经功能

脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)是一种常见的严重创伤，可导致创伤部位以下区域感觉和运动功能的不可逆损伤，且缺乏有效的治疗方法。在创伤区内抑制细胞凋亡对脊髓保护是非常重要的[1]。然而，由于SCI的病理生理机制的复杂性及多变性，还没有令人满意的药物或外科手术来治愈SCI[2]，因此，对SCI潜在治疗方法的发掘仍迫在眉睫。

神经干细胞(NSC)是指具有分化为神经元，少突胶质细胞和星型胶质细胞能力，且能够自我更新并形成神经组织的细胞[3]。NSC具有的定向迁移、组织融合及免疫豁免性，使其在损伤移植后可以很好的存活。且研究已证实NSC移植安全有效，对小鼠的正常生长发育无明显影响。

B淋巴细胞瘤-2在神经系统及其他多种组织均有表达。SCI后，Bcl-2蛋白在幸存神经元中表达量明显增加，提示它是一种神经系统重要的保护性因子。有学者发现， Bcl-2的过表达能够使中枢神经继发性损伤减轻，改善预后，但是有关机制尚未阐明。本文将Bcl-2基因转染NSC细胞，检测NSC细胞的生物学特性，并进一步探讨Bcl-2-NSC对大鼠SCI功能恢复的影响。

1　材料和方法

1.1实验动物

清洁级SD大鼠85只，1月龄，体重(230～270)g。购自唐山恒安生物工程有限公司【SCXK(冀)2010-0-055】，唐山工人医院SPF 级实验动物室常规饲养【SYXK(冀)2011-0012】。

1.2主要试剂与仪器

胰蛋白酶(美国Santa Cruz 公司)；PBS 缓冲液粉剂(福州迈新)；Western-blot蛋白检测试剂盒(美国 Santa Cruz 公司)；BCA 蛋白浓度测定试剂盒(Beyotime 公司)；细胞培养箱(美国Thermo Forma 公司)；化学发光检测试剂盒(美国Pierce)；Bcl-2单克隆抗体(北京中山试剂公司)；TUNEL染色试剂盒(Promega)；Trizol试剂(美国Invitrogen公司)；QuantiTect逆转录试剂盒(德国QIAGEN公司)；HSP-27(美国Abcam公司)；KEYPOINT 4诱发电位仪(北京市康泰医疗器械有限公司)；扫描分析软件系统(Labworks Analysis Software，美国)。1.3实验方法

1.3.1神经干细胞培养、鉴定标记、NSC及bcl-2-NSC悬液的制备

取孕14 d的SD大鼠处死，75%的酒精浸泡消毒。切取胎鼠大脑，浸泡在DMEM/F12液中，去除脑膜和血管。将去除脑膜和血管的胎脑浸泡于DMEM/F12液中，用吸管反复吹打成悬液，过100目孔筛网，过滤的悬液接种于培养瓶中，加EGF, bFGF，N2添加剂，37℃，5%CO2培养箱中培养。72 h后换液。培养神经干细胞3 d后接种到涂布多聚赖氨酸的盖玻片上，以一抗Brdu 1:400的比例，进行免疫细胞化学染色，并用DAB 显色。对形成的神经球行nestin免疫组织化学染色，进行鉴定。 将移植前2 d呈对数生长期的NSC进行离心，添加培养液，反复吹打至单细胞悬液并进行计数，将种植密度调整为1×106/mL。在培养瓶中加入感染复数(MOI)为200PFU/细胞浆含bcl-2-Ad-EGFP颗粒的储存液，于培养箱中温育48 h后离心，并弃去上清液，再次吹打至单细胞悬液并进行计数，将种植密度调整为2×107个/μL。同时制备单纯NSC悬液(浓度为2×107个/μL)。1.3.2Western-blot检测Bcl-2蛋白表达

转染后48 h，按照3组细胞,提取总蛋白，5%浓缩胶40 V衡压1 h，10%分离胶60 V恒压3.5 h，湿转14 V恒压14 h，37℃摇床封闭2 h， 洗膜10 min，3次，兔抗鼠抗体Bax或BCL-2(1∶800)4℃ 过夜；抗鼠β-actin(1∶1 000)4℃过夜。TBST洗膜5 min×4次，山羊抗兔抗体1∶700，37℃摇床孵育1.5 h，TBST 洗膜5 min×4 次。再次运用TBS洗膜10 min后DAB显色，BCL-2与β-actin的灰度积分的比值进行分析，作为BCL-2 蛋白表达的量。

1.3.3大鼠SCI模型的制备及干预

将SD大鼠进行麻醉、固定并剃毛，暴露大鼠棘突和椎板，将T8-9的棘突及部分椎板切除，并将黄韧带切除，显露出硬脑膜。按照改良Allen法操作方法依次设计打击锤重量为10 g，打击高度为2.5 cm进行脊髓打击，鼠尾及双后肢可见痉挛性伸直片刻后又松弛表示造模成功,参考Zlokovic等[4]的方法将造模成功后3 d动物再次麻醉后进行细胞移植，随机分为3组，每组24只，单独放于3个笼子里。保持动物良好的卫生条件，允许其自由采食，并给与供水。其中，对照组：SCI后注入5 μL生理盐水溶液；NSCs组：注入等量NSC悬液；bcl-2-NSCs组：注入等量bcl-2-NSC悬液(细胞数均为2×107个/μL)。

1.3.4运动功能评价

3组大鼠均于SCI后的不同时期采用BBB评分、斜板试验评价运动功能。BBB评分[5]：共22级，0级：后肢完全瘫痪，21级：功能正常，主要观察指标包括关节活动次数，运动负荷、范围，前肢、后肢及前爪、后爪、尾巴的协调程度。斜板试验：大鼠放置在光滑的木板上，体轴垂直于板的垂直轴，每个试验斜板的角度增加5度，当最大角度时大鼠可停留5秒，则认为有功能价值。

1.3.5RT-PCR及Western-blot 检测HSP-27、c-fos基因的表达

取各组大鼠损伤区的脊髓组织50 mg，Trizol 法提取总RNA，用RT-PCR两步法试剂盒将mRNA逆转录成cDNA，将cDNA行PCR扩增。HSP27的引物序列：上游5’-GGCGCTCAACCGGCAACTCA-3’,下游5’-CTCAGGGACAGGGAAGAG-3’,GAPDH：上游5’-ACCTGACCTGCCGTCTAGAA-3’,下游：5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’,c-fos：上游5’- GAC AGC CTT TCC TAC TAC CAT TTC C-3’,下游5’-CCA TCT TAT TCC TTT CCC TTC-3’反应条件：94℃ 5 min之后，94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，23个循环后再72℃延伸10 min。PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳。RT-PCR提取后的剩余物经1500 r/min 离心30 min后，取上清为粗体蛋白， Bradford法测定总的蛋白浓度。5%浓缩胶40 V衡压1 h，10%分离胶60 V恒压3.5 h，湿转14 V恒压14 h，37℃摇床封闭2 h， 洗膜10 min，3次，兔抗鼠抗体HSP-27或c-fos(1∶800)4℃ 过夜；抗鼠GAPDH(1∶1000)4℃过夜。TBST洗膜5 min×4 次，山羊抗兔抗体1∶700，37℃摇床孵育1.5 h，TBST 洗膜5 min×4 次。再次运用TBS洗膜10 min后DAB显色，HSP-27、c-fos与GAPDH的灰度积分的比值进行分析，为HSP-27、c-fos 蛋白表达的量。1.3.6TUNEL法检测细胞凋亡率

取脊髓组织进行石蜡切片处理。TUNEL法检测按德国Roche公司试剂盒购操作。待水化、37℃条件下蛋白酶K消化10 min，进行标记液标记后， 37℃下，经生物素化的地高辛反应30 min，加SABC，DAB显色。封片后对胞核含棕黄色颗粒的细胞计数。

1.3.7HE染色及荧光显微镜观察EGFP标记的NSC存活及分布

3组各随机取5只大鼠，取脊髓组织，固定用4%多聚甲醛，冲洗用生理盐水。从病变部位取长约1 cm的完整脊髓，经分级系列酒精脱水，纵向切片，厚约20 μm，进行HE染色。随机取10个视野，用高倍荧光显微镜(×20)观察EGFP标记的NSC的存活及分布情况。

1.3.8检测运动诱发电位和体感诱发电位

每组随机取5只大鼠，用KEYPOINT 4诱发电位仪检测后肢体感及运动诱发电位。将大鼠进行麻醉、固定，并准确安放参考及记录电极。直流波电脉冲刺激参数设计：3 Hz的频率，0.2 ms的波宽，5～15 mA的电流强度，50～60倍的叠加次数，后肢有轻微抽搐为参数设计良好。观察并记录数值变化。同样的方法检测运动诱发电位并记录。

1.4统计学方法

2　结果

2.1NSCs体外培养、鉴定及标记

脑组织单细胞悬液接种于培养瓶后1 h，大部分细胞沉积在瓶底，呈圆形、无突起，同时可以观察到小的细胞团，其中NSCs细胞数量较少。1 d后NSCs增多、较小、形状不规则，小部分细胞团贴壁；5 d后NSCs增多，为较大、形状规则的球形。免疫组化染色显示，NSCs球呈Nestin强阳性表达。

2.2Western-blot

基因在转染3 d及14 d后，bcl-2转染组的神经干细胞检测到 bcl-2 蛋白表达明显，而对照组和阴性转染组 bcl-2蛋白无表达，说明了bcl-2基因已稳定整合入bcl-2转染组神经干细胞中，且可以行目的蛋白的稳定表达，如图2A-B所示。

2.3运动功能评定结果

造模前所有大鼠的BBB评分、斜板试验评分差异均无显著性意义(P< 0.05)。移植后4周，NSCs组，bcl-2-NSCs组两项评分在损造模后2～4周较对照组都明显增加，差异有显著性意义(P< 0.05)。bcl-2-NSCs组两项评分在损造模后2～4周较NSCs组明显增加，差异有显著性意义(P< 0.05)，见表1。

表1　各组大鼠运动功能评定结果(n=5)

注：与对照组相比，aP< 0.05；与NSCs组相比bP< 0.05。

Note.Compared with the control group,aP<0.05;Compared with NSCs groupbP<0.05.

注：(1A)倒置微镜下观察培养的原代神经干细胞形态(×40)；(1B)神经干细胞Nestin免疫荧光化学染色阳性(×40)；(1C)EGFP标记的NSCs(×100)。图1　神经干细胞的培养、鉴定及标记Note.(1A)primary neural stem cell morphology was observed under inverted microscope cultured(×40)；(1B)neural stem cells Nestin immunofluorescence staining(×40)；(1C)EGFP-labeled NSCs(×100).Fig.1　Culture, identification and labeling of neural stem cells

注：(A)转染3 d；(B)转染14 d。图2　bcl-2蛋白在神经干细胞中的稳定表达Note.(A)Transfection 3 days；(B)Transfection 14 days.Fig.2　Bcl-2 protein was stably expressed in neural stem cells

注：(3A)对照组；(3B)NSCs组；(3C)bcl-2-NSCs组。图3　HE染色观察各组神经细胞样形态学(×40)Note.(3A)The control group；(3B)NSCs group；(3C)bcl-2-NSCs group.Fig.3　HE staining in each group of neural cell-like morphology

注：(4A)对照组；(4B)NSCs组；(4C)bcl-2-NSCs组。图4　荧光显微镜观察EGFP标记的绿色荧光细胞(×20)Note.(4A)The control group；(4B)NSCs group；(4C)bcl-2-NSCs group.Fig.4　Fluorescence microscopy of GFP-tagged green fluorescent cells

2.4HE染色和荧光显微镜观察

伤后4周，HE染色对照组可见损伤处脊髓组织断裂，为瘢痕连接，有明显空洞形成 (图3A)。NSCs组在移植部位组织空洞较对照组小，较bcl-2-NSCs组大(图3B)。bcl-2-NSCs组空洞消失(图3C)。NSCs组及bcl-2-NSCs组切片中均可见散在的EGFP标记的阳性的绿色荧光(图4A-C)：对照组为(0±0.00)个/高倍视野，NSCs组为(12.15±3.24)个/高倍视野，bcl-2-NSCs组为(27.34±4.41)个/高倍视野，各组之间差异显著(P<0.01)。

2.5HSP-27、c-fos基因和蛋白的表达

造模后7天，与对照组和NSCs组相比，bcl-2-NSCs组HSP27基因的表达显著升高，P< 0.05，c-fos基因的表达显著降低P< 0.05；与对照组比较，NSCs组GSP27蛋白的表达显著升高，P< 0.05，c-fos蛋白的表达显著降低P< 0.05，见图5。

2.6TUNEL检测细胞凋亡

凋亡神经细胞的细胞核内可见特异性棕黄色颗粒，TUNEL法测定，NSCs组中，免疫组化呈棕黄色颗粒的凋亡细胞数(20.41±4.38)明显少于对照组(30.12±3.44)(P< 0.05)，bcl-2-NSCs组凋亡细胞最少(9.57±2.31)。见图6。

2.7体感诱发电位和运动诱发电位

移植后4周，对照组体感诱发电位和运动诱发电位少量恢复，bcl-2-NSCs组感诱发电位和运动诱发电位明显恢复，波幅增高。各组大鼠体感诱发电位潜伏期和波幅，见表2。NSCs组与对照组比较差异有显著性意义(P< 0.05)。bcl-2-NSCs组与对照组比较差异有非常显著性意义(P< 0.01)。NSCs组与bcl-2-NSCs组比较差异有显著性意义(P< 0.05)，表明bcl-2-NSCs组电信号从后肢到头皮传导时间比其他组都短，传导通路已经畅通，恢复较好。

图5　脊髓损伤区HSP-27、c-fos基因与蛋白的表达Fig.5　Expression of HSP-27、c-fos gene and protein in spinal cord injury

注：(6A)对照组；(6B)NSCs组；(6C)bcl-2-NSCs组。图6　TUNEL检测各组细胞凋亡(×20)Note.(6A)The control group；(6B)NSCs group；(6C)bcl-2-NSCs group.Fig.6　TUNEL staining of each group

组别(group)体感诱发电位(somatosensoryevokedpotential,SEP)运动诱发电位(motorevokedpotentials,MEP)潜伏期(ms)波幅(μV)潜伏期(ms)波幅(μV)对照组(comparisongroup)32.241±2.4571.236±0.11616.227±0.3471.635±0.121NSCs组(NSCsgroup)26.821±2.530a1.727±0.117a12.436±0.244a2.447±0.319abcl-2-NSCs组(bcl-2-NSCsgroup)17.237±1.418b2.231±0.125b8.741±0.329b3.738±0.445b

注：与对照组相比，aP< 0.05；与NSCs组相比bP< 0.05。

Note.Compared with the control group，aP<0.05;Compared with NSCs group，bP<0.05.

3　讨论

SCI的病理损伤分为原发性SCI和继发性SCI[5]。发生前者时，损伤的脊髓组织会经历神经元凋亡、炎症反应、氧自由基损伤等破坏性及轴突再生等修复性过程，属于不可逆性损伤。后者则是由前者引发的一系列神经病理变化，给予积极的治疗手段可减慢其发生、发展，属于可控性损伤，所以目前将继发性SCI作为研究的焦点[6]。近来，Bcl-2减轻继发性SCI的作用越来越引起关注，除了抗凋亡功能外，一些研究提示，过表达的Bcl-2能够阻止由中毒、缺氧、缺乏生长因子等诱发的神经元死亡[7]，提示Bcl-2对神经功能的保护作用是多方面的[8]。

Bcl-2基因家族包括促进(Bax)和抑制(Bcl-2)细胞凋亡的两大类成员，是SCI后细胞凋亡的重要调控基因。研究认为，Bcl-2与Bax以二聚体的形式在体内发挥作用，二者的比例是决定细胞存亡的关键[9]。燕景峰等[10]研究发现，Bcl-2组表达在各个时间点上较SCI、NSC组明显增多，凋亡率降低。本实验运用多项技术，研究了Bcl-2-NSC治疗小鼠SCI后机体的恢复情况。通过Ad-EGFP为载体介导Bcl-2基因转染使神经干细胞能够明显抑制细胞凋亡、促进神经干细胞增殖及修复，与前人的研究结果一致。

HSP是其中重要的一员，主要参与稳定细胞骨架。路艳等[11]发现，HSP(heat shock proteins，热休克蛋白，简称为HSP)可与APaf-1结合，阻止形成APaf-1/Cyt-c/casPase-9凋亡复合体，进而阻止细胞凋亡，起到保护神经系统损伤的作用。在实验中我们观察到，Bcl-2高表达小鼠的脊髓标本上HSP的表达明显升高，对提高脊髓的应激性、耐受缺血缺氧等损伤明显是有利的。

本实验仅对部分内容进行了探索，尚存在许多不足之处，还需要更进一步的探究。但本实验中涉及到转基因技术已引起了研究人员的极大兴趣，也许在不久的将来会有更广阔的前景。因此继续探索并完善基因修饰NSC移植治疗SCI的理论水平和分子机制，从而使基因治疗早日应用于临床，是我们进一步研究的课题和努力的方向。

[1]Wang Y,Wang H, Tao Y,etal.NecroPtosis inhibitor necrostatin-1 Promotes cell Protection and Physiological function in traumatic sPinal cordinjury[J]. Neuroscience,2014,266:91-101.

[2]David S,LoPez-Vales R,Wee Yong V.Harmful and beneficial effects of inflammation after sPinal cord injury: Potential thera Peutic imPlications[J]. Handb Clin Neurol,2012,109:485-502.[3]Karimi-Abdolrezaee S, EftekharPour E.Stem cells and sPinal cord injury rePair[J].Adv ExP Med Biol,2012,760:53-73.

[4]Zlokovic BV, APuzzo ML. Cellular and molecular neurosurgery: Pathways from concePt to reality-Part II:vector systems and delivery methodologies for gene theraPy of the central nervous system[J]. Neurosurgery, 1997,40(4):805-813.

[5]訾英，范广宇，朱悦.脊髓干细胞移植对脊髓损伤后神经功能的影响[J]. 中华实验外科杂志，2006，23(10):1257-1258.

[6]Rahman F, Bhargava A,TiPPu SR,etal. Analysis of the immunoexPression of Ki-67 and Bcl-2 in the Pericoronal tissues of analysis[J]. Dent Res J(Isfahan), 2013,10(1):31-37.[7]Schulman JJ, Wright FA, Kaufmann T,etal.The Bcl-2 family member Bok binds to the couPling domain of inositol 1,4,5-trisPhate recePtors and Protects them from Proteolytic cleavage[J]. J Biol Chem,2013,288(35):25340-25349.

[8]Kontos CK,Fendri A,Khabir A,etal.Quantitative exPression analysis and Prognostic significance of the Bcl-2-associated X gene in nasoPharyngeal carcinoma: a retrosPective cohort study[J]. BMC Cancer,2013,13:293.

[9]张强，熊婷，张其梅,等.缺血后适应对大鼠脑缺血再灌注损伤Bcl-2和Bax蛋白表达的影响[J]. 细胞与分子免疫学杂志，2011，27(3):329-330.

[10]燕景峰，岳长波. BDNF基因修饰神经干细胞移植治疗脊髓损伤的实验研究[J]. 中国临床神经外科杂志，2006，11(9):547-550.

[11]路艳，陈莹，李宗斌，等.老龄大鼠心脏缺血预处理后热休克蛋白27的变化研究[J]. 中国全科医学，2011，14(12):1308-1310.

Bcl-2 gene-modified neural stem cell transplantation for spinal cord injury in rats

ZHANG Mei1，WANG Yue-xin1*，HOU Xiao-hua1，HONG Jun1,YIN Sheng-chun1，LI Yan1，LIU Qing-yang2

(1. Tangshan Worker’s Hospital，Tangshan 063000，China；2.Coal General Hospital，Beijing 100028，China)

ObjectiveTo investigate the bcl-2 gene modification on neurological function recovery in rats with spinal cord injury in neural stem cell transplantation. Methods Cultured rat neural stem cells by Ad-EGFP as vector-mediated side B-cell lymphoma 2 gene (bcl-2) gene transfection of neural stem cells were divided into 3 groups: control group, negative transfection group, bcl-2 transfection group. Use western-blot to detect the expression of bcl-2 protein in neural stem cells before and after transfection. 85 adult female SD rats, successful model 72, were randomly divided into control group, NSCs group, bcl-2-NSCs groups, 24/group, rat acute spinal cord injury model in accordance with a modified Allen’s method. Assess the motor function by BBB rating and the swash plate test. 7 days after modeling by RT-PCR and Western blot detection of spinal cord injury around HSP27, c - fos gene expression, TUNEL assay apoptosis. Four weeks after model drawn line HE staining and fluorescence microscopy EGFP-labeled NSC survival and distribution of the rats neurophysiological recovery by SEP and MEP.Resultsbcl-2 gene transfection of rat neural stem cells, bcl-2 transfection group and control group, negative transfection group compared to bcl-2 mRNA and protein levels were expressed (P< 0.05); lower extremity motor function in rats evaluation of bcl-2-NSCs group than NSCs group, NSCs group than the control group. 72 hours after modeling, bcl-2-NSCs number of apoptotic cells were significantly lower than the control group and NSCs group (P< 0.05). 7 days after modeling, compared with the control group and NSCs group, bcl-2-NSCs group HSP27 gene and protein expression was significantly higher than that (P< 0.05), bcl-2-NSCs group c-fos mRNA and protein expression was significantly reduced compared (P< 0.05). 4 weeks after modeling, HE staining control group showed spinal cord tissue loss and the formation of syringomyelia, no axonal through. NSCs group damage zone few of neuraxis-like structures, syringomyelia smaller, bcl-2-NSCs group showed more nerve axon-like structure, no syringomyelia. EGFP-positive cells labeled: bcl-2-NSCs group the most, NSCs group followed, no control group, and the difference between the groups was statistically significant (P< 0.05). After the 4th week, SEP and MEP latency period: bcl-2-NSCs group NSCs group> control group, and between the groups was significant difference (P< 0.05). Conclusions By Ad-EGFP as vector-mediated side B-cell lymphoma 2 gene (bcl-2) gene transfection make neural stem cells can promote cultured rat neural stem cells. bcl-2 gene-modified neural stem cell transplantation can promote the regeneration of spinal cord injury synaptic elevated HSP27 expression after spinal cord injury, reduced expression and neural cell apoptosis after spinal cord injury bcl-2 gene and improve limb movement in rats function and electrophysiological function.

Spinal cord injury;Bcl-2 gene; Modification; Neural stem cells;Transplantation;Repair;Rat;Nerve function

唐山市科技计划项目(15130254a)。

张梅(1980-)，女，本科，研究方向：脊柱脊髓损伤及其护理。E-mail：zhangmeiwang1@163.com。

王跃新(1979-)，男，硕士，研究方向：脊髓脊柱损伤。E-mail：m13102643830@163.com。

研究报告

R-332

A

1671-7856(2016)07-0035-07

10.3969.j.issn.1671-7856.2016.07.006

2016-01-12