真核表达载体GV394-Nurr1的构建及鉴定

樊秀双，郭军堂，陈安琪

(潍坊医学院临床学院，山东 潍坊　261053)



真核表达载体GV394-Nurr1的构建及鉴定

樊秀双，郭军堂，陈安琪*

(潍坊医学院临床学院，山东 潍坊261053)

目的构建含人源性Nurr1基因真核表达载体GV394-Nurr1，检测其瞬时表达对细胞内活性氧类物质(ROS)水平的影响。方法 PCR扩增人Nurr1基因,克隆至T载体，测序正确后与真核载体GV394一起,经BamHI和XhoI双酶切,T4 DNA连接酶连接,构建GV394-Nurr1；采用脂质体将GV394-Nurr1瞬时转染神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞，RT-PCR检测Nurr1基因mRNA水平，通过DCFH-DA染色检测Nurr1对细胞内ROS水平的影响。 结果 PCR及测序证实人Nurr1基因正确克隆至真核表达载体GV394; RT-PCR显示Nurr1基因mRNA水平在瞬时转染的细胞中明显增高;DCFH-DA染色显示瞬时转染Nurr1的神经母细胞瘤细胞的细胞内的ROS水平峰值较对照组明显左移。结论成功构建人源性Nurr1真核载体，可在SH-SY5Y细胞中表达并减少细胞内ROS水平，为进一步在体外研究Nurr1的功能及其与多巴胺能神经元的保护作用的关系提供了基础。

Nurr1；真核表达载体；帕金森氏病；细胞活性氧；

帕金森氏病(Parkinson disease,PD)是与年龄相关的中枢神经系统退行性疾病，临床上主要表现为静止性震颤、肌强直、动作徐缓、姿态异常等运动功能障碍和自主神经功能障碍。多巴胺代谢异常是PD发病的核心机制，几乎每一种有关调控多巴胺代谢基因的多态及突变都能影响多巴胺代谢酶的含量，共同最终导致多巴胺神经元的应激损伤，多巴胺能神经元数目上相应的减少[1]。孤核受体Nurr1广泛表达于胚胎和成体中脑黑质腹侧被盖区，作为转录调控蛋白在多巴胺能神经元发育和存活过程中起到了重要的作用[2]。基因敲除Nurr1(-)的小鼠细胞免疫荧光显示DA神经元前体细胞凋亡，最终导致中脑多巴胺能神经元发育不全[3]。本研究通过构建Nurr1真核表达载体，研究其过表达细胞内的ROS水平的影响，为研究Nurr1参与PD神经元变性的保护作用关系奠定基础，为临床指导Nurr1有可能作为帕金森病基因治疗提供了实验理论依据。

1　材料和方法

1.1主要试剂

大肠杆菌DH5α为本实验保存；质粒GV394、限制性内切酶，人脑 cDNA文库购自上海吉凯基因有限公司；Liptap脂质体、小量质粒抽提试剂盒购自碧云天公司；PCR引物、平端DNA加A试剂盒、 T载体均自上海生工； Trizol试剂、PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit、 PrimeSTAR HS DNA polymerase试剂盒均购自宝生物工程大连有限公司；DCFH-DA染色试剂盒购自于Sigma公司；其余化学试剂为进口或国产化学分析纯。

1.2实验方法

1.2.1真核表达载体GV394-Nurr1的构建与鉴定

依据NCBI NM_006186.3 NR4A2基因信息设计引物，5’-TTGGTACCGAGCTCGGATCCCGCCACC ATGCCTTGTGTTCAGGCGCAG-3’，下游引物5’-ACGGGCCCTCTAGACTCGAGTTAGAAAGGTAAAG TGTCCA GG-3’。以人脑 cDNA文库为模板，进行PCR：98℃预变性5 min，98℃变性10 s，57℃退火10 s，72℃延伸 90 s，共30个循环，最后72℃延伸 8 min。胶回收后的PCR产物利用平端DNA加A试剂盒进行加“A”后与pUCm- T载体连接并转化DH5α感受态细菌。小量提取质粒DNA进行PCR及BamHI和XhoI双酶切鉴定并送上海生工进行测序，正确克隆命名为体pCUm-T- Nurr1。BamHI和XhoI双酶切载体GV394质粒及pCUm-T- Nurr1，将纯化回收的1541bp大小的目的片段与酶切后线性化的GV394质粒用T 4DNA连接酶进行连接并转化DH5α感受态细胞，PCR反应鉴定挑选正确的克隆，命名为GV394-Nurr1。

1.2.2瞬时转染

培养神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y密度达到80%左右时，胰酶消化细胞，使每孔细胞密度达到2-6×105，均匀接种到6孔板中，置于37℃、5% CO2的培养箱中培养，确保第二天细胞密度能达到70-80%。按照脂质体转染试剂说明书，将GV394-Nurr1转染SH-SY5Y细胞，同时设空载GV394为对照组。转染24 h后，用Trizol RNA提取试剂盒抽提总RNA，通过RT-PCR检测Nurr1 mRNA的表达。Nurr1的PCR条件同1.2.1。内参β-actin引物：上游引物：5‘GACCCAGATCATGTTTGAGA 3 ’下游引物：5‘GCTTGCTGATCCACATCTGC3 ’ , PCR循环: 98℃预变性5 min，98℃变性10 s，55℃退火10 s，72℃延伸60 s，共30个循环，最后72℃延伸 8 min。

1.2.3DCFH-DA染色法检测Nurr1对细胞内ROS水平影响

胰酶消化实验组及对照组细胞，吹打成细胞悬液，1000 rpm 离心5 min，离心2次，500 μL的PBS轻轻重悬沉淀，加入工作液10 μmol/L的DCFH-DA荧光染料1 μL，室温避光孵育15 min，流氏细胞仪上机检测，用激发波长488 nm,发射波长为525 nm来检测荧光强度。每组设置三个复孔，重复三次独立实验。

1.3统计学处理

2　结果

2.1全长人Nurr1的PCR扩增

如图1A所示，PCR扩增出与预期产物大小一致的1541 bp人Nurr1 DNA片段。

2.2pCUm-T- Nurr1的鉴定

如图1B所示，小量提取质粒后，PCR扩增后得到一条1541 bp左右的条带，与预期大小一致。如图1C所示，质粒经BamHI和XhoI限制性内切酶酶切得到一条1500 bp左右的目的条带和2700 bp左右大pCUm-T载体条带，与预期大小一致。 对PCR和酶切鉴定成功的pCUm-T- Nurr1克隆送上海生工进行测序, 测序结果与Genebank碱基序列完全一致。

2.3GV394-Nurr1的鉴定

重组质粒PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果，如图1D所示，在1.5 kb左右呈现与Nurr1分子量大小相符DNA条带，结果证实人Nurr1基因成功插入真核GV394载体中。

注：(M)DNA Marker；(1)Nurr1 PCR产物；(2)pCUm-T-Nurr1 PCR产物；(3)pCUm - T- Nurr1经BamH I和X hoI酶切产物；(4)GV394-Nurr1 PCR产物。图1　琼脂糖凝胶电泳鉴定Note.(M)DNA Marker；(1)Nurr1 PCR products；(2)pCUm-T-Nurr1 PCR products；(3)pCUm - T- Nurr1 by I BamH and hoI X enzyme digestion products；(4)GV394-Nurr1 PCR products.Fig.1　Agarose gel electrophoresis

2.4RT-PCR检测Nurr1 mRNA表达

逆转录聚合酶链式PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果，如图2A所示，实验组与对照组均见特异性条带，大小为1541 bp，实验组较对照组条带亮些，图像经IPP图像系统分析，如图2B在内参灰度值大致相同的情况下，实验组Nurr1/内参的灰度值之比(0.754±0.02)较对照组Nurr1/内参的灰度值之比(0.347±0.03)明显增高，两组差异比较有统计学意义(t=19.55,P< 0.01),提示表达载体GV394-Nurr1在SHSY5Y细胞中能够瞬时表达。

2.5DCFH-DA染色法检测瞬时表达Nurr1对细胞内ROS水平影响

本实验采用DCFH-DA染色，通过流氏细胞仪检测ROS峰值的变化精确反应细胞内活性氧含量变化，ROS峰值左移提示抑制细胞内ROS表达，如图3所示，瞬时表达Nurr1的细胞内的ROS峰值较对照组明显左移，表明过表达Nurr1抑制了SH-SY5Y细胞内活性氧的产生。

3　讨论

PD是常见的一种中老年人常见的中枢神经锥体外系统疾病，其主要病理学特征是中脑黑质多巴胺能神经元选择性丧失和路易氏小体(Lewy Body)的形成[4]。迄今为止，对选择性多巴胺神经元缺失的确切病因和发病机制尚未完全阐明。研究认为，众多因素都参与了PD的发病机制，但其最终的结局是中枢神经内多巴胺含量减少，使多巴胺能神经元应激性损伤敏感性增加。因此，对中脑多巴胺能神经发育分化基因调节机制的研究有助于了解帕金森氏疾病的发病机制。

注：(A)RT-PCR图；(B)灰度扫描分析图(1)实验组Nurr1；(2)对照组Nurr1；(3)实验组β-actin；(4)对照组β-actin；(5)DNA Marker。与对照组比较，*P < 0.05。图2　Nurr1 mRNA 表达Note.(A)RT-PCR image；(B)The result of gray scale analysis；(1)Experimental group；(2)Control group；(3)Experimental group(β-actin)；(4)Control group(β-actin)；(5)DNA Marker. *P < 0.05，Compared with control group.Fig.2　The expression of Nurr1 mRNA

图3　流氏细胞仪检测瞬时表达Nurr1对细胞内ROS水平的影响Fig.3　Flow cytometry detection the effect of transient expression of Nurr1 on the intracellular

Nurr1又称孤核受体因子，定位于染色体2q22 -q23[5]，由598个氨基酸组成，分子量大约为66KD,主要分布于中脑黑质和腹侧被盖区，作为转录蛋白因子对多巴胺的发育和存活有着重要的作用。Nurr1作为配体诱导转录因子包含DNA结合区域(DBD)，配体结合区域(LBD)，N端可变区，在外界环境的刺激激活MAPK通路，调控下游基因的表达[6]。Kaoru等[7]发现在小神经胶质细胞和星型胶质细胞中Nurr1能够募集Co REST([co]repressor for element-1-silencing transcription factor)复合物形成反式通路对神经毒素物质致炎效应表现出较强的防御反应，同时通过实验性研究证实在中枢神经系统中Nurr1可以保护多巴胺神经元免受LPS和A30P α-Synuclein产生的毒害反应。实时定量PCR显示在过表达α-Synuclein大鼠中Nurr1基因表达量减少，给予体外帕金森病动物模型Nurr1及类视黄醇X受体配体的刺激后结果显示α-Synuclein表达下降[8]。因此，可以推测Nurr1蛋白表达抑制了α-Synuclein对多巴胺能神经元的毒性作用。体外研究证明，Nurr1在转录因子LmxIb(LIM homeobox transcription factor 1 beta)和EN(Engrailed)蛋白的共同参与下，通过Lmxlb驱动Pitx3(paired-like homeodomain transcription factor 3)介导调控多巴胺神经元的发育、存活[9, 10]。通过基因敲除技术，缺失Nurr1基因表达的小鼠实时定量PCR结果显示，其体内酪氨酸羟化酶(TH)的表达含量下降，活性水平降低，多巴胺含量减少，多巴胺能神经元数量减少，小鼠表现出对MPTP毒素的敏感性增加，表明降低Nurr1表达及其活性，失去了对多巴胺能神经元的保护作用[11, 12]。Nurr1表达促进多巴胺能神经元发育、存活、成熟方面起到了重要的作用，但是Nurr1如何参与调控尚存在争议。

本研究以人脑 cDNA文库为模板，成功扩增出人全长Nurr1基因，并构建了真核细胞表达载体GV394-Nurr1，利用阳离子脂质体转染技术将其转染到SH-SY5Y细胞内，发现该基因能够在SH-SY5Y细胞内表达，且能够降低了细胞内的ROS水平，这为进一步研究Nurr1对多巴胺能神经元的分化、成熟的机制提供了基础。

[1]Wise RA. Dopamine, learning and motivation[J]. Nat Rev Neurosci, 2004, 5(6):483-494.

[2]Simon HH, Bhatt L, Gherbassi D,etal. Midbrain dopaminergic neurons:determination of their developmental fate by transcription factors[J]. Ann N Y Acad Sci, 2003, 991:36-47.

[3]张振. Nurr1基因激活剂在帕金森病模型中的神经保护机制研究[D]. 博士. 山东大学; 2012.

[4]Kosaka K.Latest concept of Lewy body disease[J]. Psychiatry Clin Neurosci,2014, 68(6):391-394.

[5]Nolan YM, Sullivan AM, Toulouse A.Parkinson’s disease in the nuclear age of neuroinflammation[J]. Trends Mol Med, 2013, 19(3):187-196.

[6]Nordzell M, Aarnisalo P, Benoit G,etal.Defining an N-terminal activation domain of the orphan nuclear receptor Nurr1[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2004, 313(1):205-211.

[7]Saijo K, Winner B, Carson CT,etal.A Nurr1/CoREST pathway in microglia and astrocytes protects dopaminergic neurons from inflammation-induced death[J]. Cell, 2009, 137(1):47-59.

[8]Volakakis N, Tiklova K, Decressac M,etal. Nurr1 and Retinoid X Receptor Ligands Stimulate Ret Signaling in Dopamine Neurons and Can Alleviate alpha-Synuclein Disrupted Gene Expression[J]. J Neurosci ,2015, 35(42):14370-14385.

[9]Vergano-Vera E, Diaz-Guerra E, Rodriguez-Traver E,etal.Nurr1 blocks the mitogenic effect of FGF-2 and EGF, inducing olfactory bulb neural stem cells to adopt dopaminergic and dopaminergic-GABAergic neuronal phenotypes[J]. Dev Neurobiol 2015, 75(8):823-841.

[10]Hong S, Chung S, Leung K,etal.Functional roles of Nurr1, Pitx3, and Lmx1a in neurogenesis and phenotype specification of dopamine neurons during in vitro differentiation of embryonic stem cells[J]. Stem Cells , 2014, 23(5):477-487.

[11]Alavian KN, Jeddi S, Naghipour SI,etal.The lifelong maintenance of mesencephalic dopaminergic neurons by Nurr1 and engrailed[J]. J Biomed Sci, 2014, 21:27.

[12]谭雪锋, 金国华. PD模型大鼠黑质中Nurr1和TH的表达变化及其意义[J].神经解剖学杂志,2009.(01): 16-20.

The construction and identification of eukaryotic expression vector GV394-Nurr1

FAN Xiu-shuang,GUO Jun-tang,CHEN An-qi*

(Clinical College，Weifang Medical University，Weifang 261053,China)

ObjectiveTo construct the eukaryotic expression vector GV394-Nurr1 containing humanNurr1 gene and to study the effects of transient transfection ofNurr1 on intracellular reactive oxygen species level. Methods The full-length of human Nurr1 gene amplified by PCR was subcloned into T vector and sequenced. GV394-Nurr1 vector was constructed by BamHI and XhoI double digestion and then T4 DNA ligase conjunction. GV394-Nurr1 was transfected into SH-SY5Y cells by liposome transfection technique; The mRNA ofNurr1 was detected by RT-PCR; The effect ofNurr1 expression on intracellular reactive oxygen species (ROS)was detected by (DCFH-DA) staining.ResultsPCR and sequencing confirmed that theNurr1 gene was correctly cloned into eukaryotic expression vector GV394. The RT-PCR results showed that theNurr1 mRNA expression in the neuroblastoma SH-SY5Y cells transiently transfectedNurr1 was higher than that in the control group. DCFH-DA staining showed that the level of reactive oxygen peak in neuroblastoma cells transiently transfectedNurr1 obviously shifted to the left compared to the control group. ConclusionsThe humanNurr1 gene eukaryotic expression vector was successfully established and its high expression in the neuroblastoma SH-SY5Y cell line significantly decreased the ROS level. This provide the basis for further study on the function ofNurr1 in vitro and its relationship with the protective effect of dopaminergic neurons.

Nurr1; Eukaryotic expression vector; Parkinson disease; Reactive oxygen species

山东省自然科学基金(ZR2011HM014)。

樊秀双(1990-)，女，硕士研究生，研究方向: 帕金森病发病机制的研究。 Email: Fanxiushuang0314@163.com。

陈安琪 (1981-)，女, 医学硕士，研究方向：帕金森发病机制。Email:chenanqi_1981@163.com。

研究报告

R-332

A

1671-7856(2016)07-0031-05

10.3969.j.issn.1671-7856.2016.07.005

2016-03-31