星点设计-效应面法优化柚皮素包合物的制备工艺

王章姐，李晶晶，胡容峰

（1.安徽新华学院 药学院，安徽 合肥 230088；2.安徽中医药大学 药学院，安徽 合肥 230031；3.安徽省中药研究与开发重点实验室，安徽 合肥230038）

星点设计-效应面法优化柚皮素包合物的制备工艺

王章姐1，李晶晶1，胡容峰*2，3

（1.安徽新华学院 药学院，安徽 合肥 230088；2.安徽中医药大学 药学院，安徽 合肥 230031；3.安徽省中药研究与开发重点实验室，安徽 合肥230038）

研究星点设计-效应面法优化柚皮素-β-环糊精（NAR-β-CD）包合物的制备工艺。采用搅拌法制备NAR-β-CD包合物，以β-CD与NAR的投料质量比、包合时间、包合温度为自变量，以包封率、包合物得率为因变量，采用星点设计-效应面优化法，对结果进行多元线性回归和二项式拟合，经效应面法预测最佳工艺条件，并作验证试验。并比较NAR-β-CD包合物和NAR的累积溶出率。NAR-β-CD包合物的最佳工艺：β-CD与NAR投料质量比为5∶1，包合时间为1.412 h，包合温度为48.11℃。包合率和包合物得率预测值与理论值的偏差分别为1.43%、1.99%。NAR和NAR-β-CD包合物的累积溶出率分别为37.15%，为83.24%。

NAR；β-环糊精；包合率；包合物得率；星点设计；效应面

柚皮素（naringenin，NAR）是一种二氢黄酮类化合物，具有抗肿瘤、抗炎、镇咳、抗氧化等多方面生物活性［1-3］，但NAR水溶性和脂溶性均较差、口服生物利用度较低，故其口服制剂在临床上应用受到了限制。目前包合物的制备多采用正交设计或均匀设计法进行优化，虽然实验设计相对简单，实验次数较少，但精密度低。星点设计-效应面法是国内近年来常用的集统计学和数学方法于一体的实验设计和优化方法，通过线性回归和二项式拟合获得最佳工艺参数［4-5］。作者采用星点设计-效应面法优化NAR-β-CD包合物的制备工艺，并考察了NAR和NAR-β-CD包合物的累积溶出率。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

NAR原料药 （批号HK20131222，质量分数98%，陕西慧科植物开发有限公司产品）；NAR对照品（批号110722-201018，中国药品生物制品检定所产品）；β-环糊精 （上海源叶生物科技有限公司产品）；乙醇等其余试剂均为分析纯。

1.2仪器

DF-101S型智能集热式恒温加热磁力搅拌器：河南省予华仪器有限公司产品；SHZ-DI-Ⅱ型循环水式真空泵：浙江黄岩求精真空泵厂产品；UV-2550紫外-可见分光光度仪：日本岛津公司产品；Autoscience AS3120超声波清洗机：奥特赛恩斯仪器有限公司产品；BT125D电子分析天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司产品：DZF1.0型真空干燥箱：上海长源仪器设备厂产品；CP2115D电子天平：Satorius公司产品。

1.3方法

1.3.1NAR-β-CD包合物的制备称取适量β-CD溶于水中，加热溶解制成β-CD饱和水溶液，备用。称取一定量NAR原料药，加入适量体积分数70%乙醇，置恒温磁力搅拌中，加入β-CD饱和水溶液，磁力加热搅拌一定时间，静置，放入冰箱中冷藏24 h，真空抽滤，用无水乙醇多次洗涤滤饼，干燥，得到橙黄色固体即为NAR-β-CD包合物［6］。

1.3.2对照品储备液的制备取在105℃干燥至恒重的NAR对照品20mg，精密称定，置100mL容量瓶中，加体积分数70%乙醇适量，摇匀使溶解，再加体积分数70%乙醇至刻度，精密量取5 mL置50 mL量瓶中，加体积分数70%乙醇稀释至刻度，即得20mg/L对照品溶液。

1.3.3供试品溶液的制备取NAR-β-CD包合物适量，加体积分数70%乙醇溶解配成一定质量浓度的供试品溶液。

1.3.4紫外检测波长的扫描精密量取NAR对照品溶液适量，在200～600 nm波长范围内进行全波长扫描，选取最大吸收波长作为NAR含量测定时的检测波长。

1.3.5评价指标以NAR-β-CD包合物包合率（Y1）和包合物得率 （Y2）评价指标。Y1=包合物中NAR的质量/投入NAR的质量；Y2=干燥包合物的质量/（β-CD的质量+NAR的质量）

1.3.6星点设计-效应面法优化工艺通过前期预实验选择出对包合率、包合物得率有影响的3个因素为自变量：β-CD与NAR的投料质量比 （X1）、包合时间（X2）、包合温度（X3），并分别进行单因素实验，从而确定3个自变量水平范围分别为X1：1∶1～6∶1；X2：0.5～5 h；X3：40～80℃。根据星点设计原理，每个因素设置5个水平，分别用-α、-1、0、1、α表示，本实验中α=1.682。星点设计因素水平见表1，试验安排及结果见表2［7］。

表1　星点设计因素水平表Table 1　Independent variables and levels

表2　星点设计表与结果Table 2　Experiment design and results

2　结果与分析

2.1NAR的含量测定

2.1.1紫外检测波长的确定经全波长扫描，结果显示NAR在288 nm和322 nm处有最大吸收波长，由于β-CD在288 nm处也有吸收，为避免处方中β-CD的干扰，故选用322 nm处作为NAR含量测定时的检测波长。

2.1.2标准曲线的绘制精密量取NAR对照品储备液3、4、5、6、7、8mL于10mL容量瓶中，加入体积分数70%乙醇至刻度，得到6、8、10、12、14、16 mg/L的对照品溶液。以70%乙醇为空白对照溶液，照紫外-可见分光光度法 （《中国药典》2010年版一部附录VA）试验，在322 nm波长处测定吸光度。以对照品浓度C为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制NAR的标准曲线，得回归方程A=0.052 1C+0.035 0，r=0.992 7，表明NAR在6～16 mg/L范围内线性关系良好。

2.1.3精密度试验配制高、中、低3个质量浓度（14、10、6 mg/L）的NAR对照品溶液，对NAR进行日间和日内差别的测定。日内精密度RSD分别为1.68%、2.31%、1.96%（n=5）；日间精密度RSD分别为1.25%、2.42%、2.37%（n=5），结果显示本方法精密度良好。

2.1.4稳定性试验取供试品溶液，每隔5min测定一次，记录吸光度，连续测定6次，计算NAR吸光度的RSD为1.06%，表明供试品溶液在30 min内稳定。

2.1.5重复性试验取NAR-β-CD包合物6份，平行配制成供试品溶液进行测定，连续测定，记录吸光度，计算NAR的RSD为0.92%，表明该方法重复性较好。

2.1.6回收率试验按处方量的80%、100%、120%加入NAR对照品，平行制备3份，测定样品中NAR的量，计算回收率。结果平均回收率分别为98.42%、98.85%、99.14%，RSD分别为1.83%、2.36%、2.49%。

2.2星点设计-效应面法优化工艺

2.2.1模型拟合采用Design Expert 8.05软件，分别对各因素水平进行多元线性回归和非线性回归（二项式公式拟合），多元线性回归方程：包合率C= 87.42+4.57A+5.70B+2.39C，r=0.729；包合物得率Y2= 62.76+2.51A+3.82B+1.74C，r＝0.665；多元线性回归方程相关系数均较低，表示自变量与因变量之间线性相关性较差，多元线性回归拟合度不佳，预测性较差，故采用二项式拟合。二项式拟合模型为包合率Y1=95.48+4.57A+5.70B+2.39C+0.61AB+0.17AC+ 0.071BC-5.05A2-3.97B2-2.78C2，r=0.964；包合物得率Y2=68.95+2.51A+3.82B+1.74C-0.52AB-0.82AC-1.33BC-4.21A2-2.57B2-2.29C2，r=0.982。两个二项式拟合方程的相关系数分别是0.964和0.982，表明此设计模型拟合程度良好，可以用此模型对NAR包合物工艺进行预测和分析。

2.2.2效应面优化由Design Expert 8.05软件绘制不同影响因素对于响应值的三维曲线，分别固定投料质量比、包合时间和包合温度3个影响因素其中之一，考察其他2个因素对包合率、包合物得率的效应曲面图，结果见图1。根据方程和响应面图确定NAR包合物的最优工艺参数：β-CD与NAR投料质量比为5∶1，包合时间为1.412 h，包合温度为48.11℃。

图1　包合率，包合物得率的效应面的三维图Fig.1　Response surface p lot（3D）of the bias for the inclusion ratio andinclusion com plexes yield

2.3验证试验

根据优化的最佳工艺条件，平行进行3组NAR包合物验证试验，并对包合率和包合物得率进行测定，结果见表3。其中偏差＝（预测值－实测值）/预测值。通过验证实验可知，星点设计-效应面法所建立的模型预测性良好，方法可行，可较好地应用于NAR包合物的工艺优化。

2.4NAR-β-CD包合物溶出度测定

表3　星点设计-效应面优化法验证Table 3　Verification of the Central composite designresponse surfacemethodology

按中国药典2010年版（第二部）溶出度测定法第三法测定NAR-β-CD的体外溶出度。以100mL人工胃液（含质量分数2%PEG400）作为溶出介质，并设定溶出介质温度恒定在在 （37±0.5）℃，再将NAR-β-CD包合物及NAR分别置于相同的溶出介质中，设置转速为100r/min，于5，10，15，30，45，60，70，90 min吸取溶出液10 mL，并补充等体积含质量分数2%PEG400的溶出介质，用微孔滤膜过滤，取续滤液按2.2项下含量测定方法进行测定，计算出不同时间NAR的累积释药率，结果见图2。

图2　NAR及NAR-β-CD包合物的累积溶出曲线Fig.2　In vitro release curve of NAR and NAR-β-CD

3　结语

将药物分子与-包合材料通过范德华力形成包合物后，可使溶解度增大，稳定性提高，毒副作用降低等作用，还可调节药物在体内的释放速率，有效提高药物生物利用度，可用于制备缓控释制剂和靶向制剂。

采用搅拌法制备NAR-β-CD包合物，操作方法简单，易于工业化生产；通过预实验初步筛选出投料质量比、包合时间、包合温度范围，采用星点设计-效应面发优化NAR-β-CD包合物制备工艺，经验证实验证明，星点设计-效应面法对制备工艺进行优化，其试验次数少、精度高，对结果进行多元线性回归和二项式拟合，经效应面法预测最佳工艺条件，所建立的模型相关系数较高，预测性较好，对开发研究NAR-β-CD包合物新剂型奠定基础。

在包合过程中，药物分子先溶解在适当的溶剂中，再与-β-CD形成包合物，由于疏水力是促进包合的主要作用力，故包和条件通常在水或不同浓度的乙醇中进行，NAR水溶性较低，在制备NAR-β-CD包合物时，先将NAR溶解在体积分数70%乙醇中，经实验发现溶解效果较好，且乙醇易于挥发，再与β-CD形成包合物，有利于包合物的形成。

比较NAR和NAR-β-CD包合物在人工胃液中90 min内的累积溶出率，NAR为37.15%，NAR-β-CD包合物为83.24%，结果表明NAR制成NAR-β-CD包合物后溶出度显著提高。

［1］Fa Yun Zhang，Gang Jun Du，Ling Zhang，et al.Naringenin nnhances the anti-tumor effect of doxorubicin through selectively inhibiting the activity ofmultidrug resistance-associated proteinsbutnotP-glycoprotein［J］.Pharmaceutical Research，2009，26 （4）：914-925.

［2］Feng-Lin Yen，Tzu-HuiWu，Liang-Tzung Lin，etal.Naringenin-loaded nanoparticles improve the physicochem ical propertie and the hepatoprotective effects of naringenin in orally-administered rats w ith CCl4-Induced acute liver failure life［J］. Pharmaceutical Research，2009，26（4）：893-902.

［3］杨宏亮，田珩，李沛波，等.柚皮苷及柚皮素的生物活性研究［J］.中药材，2007，30（6）：752-754. YANG Hongliang，TIAN Heng，LIPeibo，etal.Investigate on the biologicalactivitiesof Naringin and Naringenin［J］.Journal of Chinese MedicinalMaterials，2007，30（6）：752-754.（in Chinese）

［4］刘艳杰，项荣武.星点设计-效应面法在药学试验中的应用［J］.中国现代应用药学杂志，2007，24（6）：455-457. LIU Yanjie，XIANG Rongwu.Application of central composite design/response surfacemethodology in pharmacy experiment design［J］.Chinese Journal of Modern Applied Pharmacy，2007，24（6）：455-457.（in Chinese）

［5］李颍，曾茂贵，郑笈，等.星点设计-效应面法优化鱼腥草挥发油-β-环糊精包合物的制备工艺［J］.中草药，2014，45（13）：1855-1862. LIYing，ZENG Maogui，ZHEN Ji，et al.Optim ization of preparation of volatile oil from Houttuynie Herba-β-cyclodextrin inclusion complex by central composite design-response surfacemethod［J］.Chinese Traditional and Herbal Drugs，2014，45 （13）：1855-1862.（in Chinese）

［6］徐新荣，于海涛，杭丽，等.柚皮素β-环糊精包合物的制备及对模型大鼠脉络膜新生血管形成的抑制作用［J］.中国药房，2014，25（11）：981-984. XU Xinrong，YU Haitao，HANG Li，et al.Preparation of inclusion complex of naringenin andβ-cyclodextrin and inhibitory effectsof iton choroidalneovascularization inmodel rats［J］.China Pharmacy，2014，25（11）：981-984.（in Chinese）

［7］Wu w，CuiG H.Central composite design and response surfacemethod and itsapplication in pharmacy［J］.Foreign Medical Sciences Section of Phamacy，2000，27（5）：292-298.

App lication of the Central Com posite Design and Response Surface M ethodology to the Preparation Optim ization of Naringenin-β-Cyclodextrin Inclusion Com p lexes

WANG Zhangjie1，LIJingjing1，HU Rongfeng*2，3
（1.School of Pharmaceutical Sciences，Anhui Xinhua College，Hefei 230088，China；2.School of Pharmacy，Anhui University of Traditional Chinese Medicine，Hefei 230031，China；3.Key Laboratory of Research and Development of Chinese Medicine in Anhui Province，Hefei230038，China）

The central composite design and response surfacemethodologywere applied to optimize the preparation technology of naringenin-β-cyclodextrin inclusion complexes.The inclusion ratio and the yield of inclusion complexeswere studied as independentvariables，using several dependent variables such as stirring，themass ratio of NAR-β-CD，inclusion time，and inclusion temperature. The results were fitted by linear equations and second-order polynom ial equation based on the central composite design and response surfacemethod.The optimal inclusion processwas predicted according to formulation and further verified by experiments.The cumulative dissolution ratesof the NAR-β-CD inclusion complexes and the NAR were comparatively studied.The optimal conditionfor the preparation of NAR-β-CD inclusion complexeswas achieved w ith a ratio of 5∶1（β-CD∶NAR），inclusion time of 1.412 h，and inclusion temperature at 48.11℃，where the bias for the prediction valueand theoreticalvalue of the inclusion ratio and the yield of inclusion complexeswere 1.43%and 1.99%，while the cumulative dissolution rate of NAR and NAR-β-CD inclusion complexeswere37.15%and 83.24%，respectively.

Naringenin，β-cyclodextrin，inclusion ratio，yield of the inclusion complexes，central composite design，response surface

TS 23

A

1673—1689（2016）04—0438—05

2014-11-19

安徽高校自然科学研究项目（KJ2016A312）；国家级大学生创新创业训练计划项目（201312216024）；安徽新华学院校级科研项目（2013zr008）；安徽新华学院校级质量工程项目（2013jgkcx02）。

王章姐（1982—），女，安徽安庆人，理学硕士，讲师，主要从事药物新剂型研究。E-mail：40462634@qq.com

胡容峰（1965—），女，理学博士，教授，主要从事缓控释制剂技术研究。E-mail：hurongfeng@163.com