金黄色葡萄球菌DPO-PCR快速检测方法的建立与应用

李丹丹， 徐义刚，邱索平， 王 昱，高会江， 高慎阳

（1.海南出入境检验检疫局 检验检疫技术中心，海南 海口 570311；2.东北农业大学 动物医学学院，黑龙江 哈尔滨150030；3.从化出入境检验检疫局，广东 从化510900；4.重庆出入境检验检疫局 检验检疫技术中心，重庆404100；5.中国农业科学院 北京畜牧兽医研究所，北京 100193；6.辽宁医学院 畜牧兽医学院，辽宁 锦州121001）

金黄色葡萄球菌DPO-PCR快速检测方法的建立与应用

李丹丹1， 徐义刚*2，邱索平3， 王 昱4，高会江5， 高慎阳6

（1.海南出入境检验检疫局 检验检疫技术中心，海南 海口 570311；2.东北农业大学 动物医学学院，黑龙江 哈尔滨150030；3.从化出入境检验检疫局，广东 从化510900；4.重庆出入境检验检疫局 检验检疫技术中心，重庆404100；5.中国农业科学院 北京畜牧兽医研究所，北京 100193；6.辽宁医学院 畜牧兽医学院，辽宁 锦州121001）

为建立检测金黄色葡萄球菌（SA）的PCR方法，以SA Sa442基因为靶基因设计了一对双启动寡核苷酸引物（DPO），建立了SA的DPO-PCR快速检测方法。结果显示，在45～65℃退火温度范围内均能高效地扩增出目的基因，表明DPO引物对退火温度不敏感，该方法的灵敏度为2.27×102cfu/mL，同时DPO引物特异性强，与其他菌株无非特异性扩增反应。利用该方法和行标法分别对采集的175份样品进行检测，均共计检出13份SA阳性样品，两者符合率为100%。作者建立的DPO-PCR方法设计简单、特异性强，具有良好的实用性，为快速准确检测SA提供新的检测手段。

金黄色葡萄球菌；Sa442基因；DPO-PCR

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）是一种重要的人畜共患病致病菌，具有重要的公共卫生意义。在食品微生物检验工作中，金黄色葡萄球菌是进出口动物性食品必检的食源性致病菌。食物中带有的SA主要是由原料带入或在生产、包装和烹调过程中污染，在通风不良的高温环境中，易滋生该菌并产生肠毒素，人类因饮食受其污染的食品而感染［1-2］，主要引起食物中毒、肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至引起败血症、脓毒症等全身性感染［3-4］。因此，建立快速、准确而且操作简便的检测方法对预防SA的感染和保障食品安全具有重要意义。

传统的增菌、分离和生化鉴定方法，特异性差、灵敏度低且耗时长、操作繁琐、受环境及主观因素影响大。通常情况下，鉴定一种细菌需要5～7 d，严重影响检测效率［5-6］。聚合酶链反应（PCR）技术具有快速、特异性强和灵敏度高等特点，是目前病原微生物检测主要采用的检测技术之一。引物设计是建立有效PCR方法的关键。但是，在设计引物时，为了防止非特异性扩增，不仅需要对引物进行筛选还要优化退火温度，因此引物设计工作量加大，检测效率不高。

双启动寡核 苷 酸 引 物（dual-priming oligonucleotide，DPO）是一种新型的引物设计方法，DPO引物设计简单且对退火温度不敏感，引物设计过程中不需要对引物进行筛选以及对退火温度进行优化，简化了普通PCR方法引物设计和反应条件优化步骤［7-10］；另外，DPO引物与模板发生错配的几率小，因为只要有3个以上碱基发生错配，就不会成功扩增［11-12］，比常规PCR引物的特异性更强，所以利用DPO引物建立的PCR方法，其检测结果比常规PCR方法更为精确。作者利用该技术，建立了SA DPO-PCR快速检测方法，为快速准确检测SA提供新的检测手段。

1　材料与方法

1.1菌株

标准菌株来自美国典型菌种保藏中心（ATCC），分离株由海南出入境检验检疫局检验检疫技术中心实验室和黑龙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心实验室分离保存（见表1）。细菌培养基购于北京陆桥技术有限公司。

表1　试验用菌株Table 1　Bacteria stains

1.2主要试剂

细菌基因组DNA提取试剂盒购自TIANGEN公司，增菌培养基BPW购自北京兰伯瑞公司，TaqDNA聚合酶、dNTP、MgCl2均购自TaKaRa公司。

1.3方法

1.3.1引物设计以SA高度保守的Sa442基因为靶基因，经BLAST分析，选取Sa442基因保守区域设计DPO引物，详见表2，引物由上海生工生物工程公司合成。

1.3.2细菌DNA提取将表1中的菌株分别接种于5 mL BPW培养基中，培养过夜，取1 mL菌液，利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌DNA，-20℃保存备用。试剂盒法提取细菌。

表2　引物序列Table 2　Primers used in this study

1.3.3DPO-PCR反应25μL反应体系：10×PCR Buffer（Mg2+free）2.5μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.1μL，Mg2+（25 mmol/L）2.5μL，dNTP（2.5 mmol/L）1.5μL，上/下游 DPO引物（10μmol/L）各 0.5μL，DNA模板1.0μL，去离子水补充至25μL。

反应程序：95℃5 min；95℃30 s、59℃45 s、72℃45 s，30个循环；72℃终延伸10 min，经琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果。

1.3.4DPO-PCR退火温度不敏感性试验退火温度范围设为45～65℃，以常规引物PCR方法作为参照，进行DPO-PCR扩增试验，经琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果。

1.3.5DPO-PCR灵敏度实验将菌体浓度约为2.27×108cfu/mL的SA进行10倍梯度稀释，经试剂盒提取每级稀释度细菌DNA，以此作为模板进行DPO-PCR反应，经琼脂糖凝胶电泳检测确定其检测灵敏度。

1.3.6DPO-PCR特异性实验利用建立的SA DPO-PCR检测方法检测表1中所示的菌株，以验证本方法的特异性。

1.3.7方法验证将建立的SA DPO-PCR检测方法应用于检验检疫实践工作中，其检测结果经传统方法复验，以验证该方法的可靠性。

2　结果

2.1SA DPO-PCR检测方法的建立

以SA高度保守的Sa442基因为靶基因，设计DPO引物，经反应体系优化，建立了SA DPO-PCR检测方法，经琼脂糖凝胶电泳检测在约434 bp处有特异性电泳条带（图1）。

图1　SA DPO-PCR检测方法的建立Fig.1　Development of DPO-PCR　method　for Staphylococcus aureus

2.2DPO-PCR退火温度不敏感性

在45～65℃的退火温度范围内，利用设计的DPO引物均能高效地扩增出目的基因，说明DPO引物对退火温度不敏感，而常规PCR引物则存在最适退火温度（图2）。

2.3DPO-PCR方法检测灵敏度

灵敏度试验结果显示，利用建立的DPO-PCR方法能够有效地检测出浓度为2.27×102CFU/mL的SA，即该方法检测SA的灵敏度为2.27×102CFU/mL（图3）。

2.4DPO-PCR方法检测特异性

利用建立的DPO-PCR方法检测表1中所示细菌，仅SA为DPO-PCR阳性，其它菌株为阴性，且无非特异性扩增（图4（a）），而常规PCR方法特异性较差，存在交叉反应（图4（b））。

图2　DPO引物退火温度不敏感性Fig.2　Insensitivity of DPO primers for the annealing tem peratures

图3　SA DPO-PCR检测方法灵敏度Fig.　3　Detection　sensitivity　of　DPO　-PCR　for Staphylococcus aureus

2.5方法实践应用

利用建立的金黄色葡萄球菌DPO-PCR方法对175份肉类、果蔬类、鲜牛奶和鸡蛋等样本进行检测，共检出13份SA阳性样本，经行标法（SN/T 1870-2007）复检，两者检测结果一致，显示出良好的实用性和可靠性。

3　结语

图4　SA DPO-PCR检测方法的特异性Fig.4　Specificity of DPO-PCR for Staphylococcus aureus

目前，包括中国在内的绝大多数国家针对食源性致病菌的检测仍主要依靠传统细菌分离鉴定的方法，即首先利用选择性培养基增菌，进而结合生化及血清学方法进行鉴定。传统检测方法存在检测效率低、灵敏度低且耗时长、操作繁琐等不足。通常情况下，鉴定一种细菌需要5～7 d，而针对一些生化特性复杂的细菌，如单增李斯特氏菌的检测周期可长达20 d之久，严重影响了检测鉴定的周期，很难适应现代化食品安全快速检测的需要。SA作为一种重要的食源性致病菌亦是进出口动物性食品必检微生物。因此，建立快速、准确的检测方法对防止SA的感染和提高SA的检测效率具有重要意义。

PCR技术具有快速、特异性强和灵敏度高等特点，是目前食源性致病菌检测主要采用的检测技术之一。在此基础之上，又相继发展了DNA探针技术、实时荧光PCR技术以及PCR结合变性高效液相色谱（DHPLC）技术等，虽然能够满足快速检测的需求，但是对引物设计的要求很高，不仅需要对引物进行筛选，而且需要优化退火温度，增加了试验操作步骤，费时又费力。作者引入一种新颖的dual priming oligonucleotide（DPO）引物设计方法，DPO引物结构特殊，具有比常规PCR引物更强的特异性，并且引物自身以及引物间难形成二级结构且对退火温度不敏感，试验过程中不需要对引物进行筛选以及对退火温度进行优化，简化了操作步骤，提高了检测效率。

基于DPO引物的设计方法建立了SA的DPOPCR特异性检测方法。试验结果显示，利用设计的DPO引物在45～65℃的退火温度范围内均可实现SA靶基因的高效扩增，不需要对退火温度进行优化，而常规PCR引物则存在最适退火温度。灵敏度试验结果显示，利用建立的DPO-PCR方法能够有效地检测出浓度为2.27×102CFU/mL的SA。特异性结果显示，利用设计的DPO引物能够准确地检测出目标菌SA，与其它菌株无交叉反应和非特异性扩增，而常规PCR方法特异性较差，存在交叉反应。临床样品检测结果表明，利用建立的SADPO-PCR检测方法能够对实际样品中的SA进行准确检测，与行标法（SN/T 1870-2007）的检测结果一致，具有良好的实用性。

［1］刘金华，王蓓蕾，马路遥，等.金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157、普通变形杆菌和副溶血弧菌多重PCR检测体系的构建［J］.中国免疫学杂志，2012，28（12）：1120-1124. LIU Jinhua，WANG BeiLei，MA Luyao，et al.Development and application of themultiplex PCRmethod for the detection of Staphylococcus aureus，E.coli O157，Proteus vulgaris and Vibrio parahaemolyticus［J］.Chinese Journal of Immunology，2012，28（12）：1120-1124.（in Chinese）

［2］Sagoo SK，Little C L，Greenwood M，etal.Assessmentof themicrobiological safety of dried spices and herbs from production and retailprem ises in the United Kingdom［J］.Food M icrobiology，2013，26：39-43.

［3］索玉娟，于宏伟，凌巍，等.食品中金黄色葡萄球菌污染状况研究［J］.中国食品学报，2008，8（3）：88-93. SUO Yujuan，YU Hongwei，LINGWei，etal.Analysis on the contam ination of Staphylococcus aureus in food［J］.Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology，2008，8（3）：88-93.（in Chinese）

［4］Rall V L，Vieira FP，Rall R，etal.PCR detection of staphylococcalentero toxin genes in Staphy lococcusaureus strains isolated from raw and pasteurizedmilk［J］.Veterinary M icrobiology，2008，132（3-4）：408-413.

［5］徐晓可，吴清平，张菊梅，等.食品中金黄色葡萄球菌多重PCR检测方法的研究［J］.食品与生物技术学报，2011，30（1）：84-89. XU Xiaoke，WU Qingping，ZHANG Jumei，etal.Studies on Detection of Staphylococus aureus in Foods by Multiplex PCR［J］. Journal of Food Science and Biotechnology，2011，30（1）：84-89.（in Chinese）

［6］A ltekruse S F，Stern N J，Fields P I，et al.Campylobacter jejuni an emerging food borne pathogen［J］.Emerging Infectious Diseases，2012，5（1）：28-35.

［7］Ryan M M.Guillain-Barre syndrome in childhood［J］.Journal Paediatrics and Child Health，2011，41：237-241.

［8］ColwellRR.Global climateand infectious diseases：the cholera paradigm［J］.Science，2011，274：2025-031.

［9］Thompson F L，Iida T，Sw ings J.Biodiversity of vibrio［J］.M icrobiology and M olecular Biology Reviews，2012，68（3）：403-431.

［10］王娜，陶妍.水产品三种致病菌多重PCR检测方法的建立［J］.食品与生物技术学报，2009，28（3）：397-402. WANG Na，TAO Yan.Establishmentofamultiplex PCR for detection of three typesof pathogen in aquatic foods［J］.Journal of Food Science and Biotechnology，2009，28（3）：397-402.（in Chinese）

［11］Chun JY，Kim K J，Hwang IT，etal.Dual prim ing oligonucleotide system for themultiplex detection of respiratory viruses and SNPgenotyping of CYP2C19 gene［J］.Nucleic Acids Res，2013，35（6）：4046.

［12］WOO H Y，PARK H，KIM B I，etal.Evaluation of dual prim ing oligonucleotide（DPO）-based multiplex PCR for detection of HBV YMDDmutants［J］.Archives of Virology，2013，153（11）：2019-2025.

A DPO-PCR M ethod for the Rapid Detection of Staphylococcus aureus

LIDandan1，XU Yigang*2， QIU Suoping3， WANG Yu4，GAO Huijiang5， GAO Shenyang6
（1.Inspection&Quarantine Technology Center of Hainan Entry-Exit Inspection&Quarantine Bureau，Haikou 570311，China；2.College of Veterinary Medicine Northeast Agriculture University，Harbin 150030，China；3. ConghuaEntry-Exit Inspection&QuarantineBureau，Conghua，510900，China；4.Inspection&Quarantine TechnologyCenter of Chongqing Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Chongqing 404100，China；5. Institute of Animal Science，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193，China；6.Department of Animal Husbandry and Veterinary Medicine，Liaoning Medical University，Jinzhou 121001，China）

A dual-prim ing oligonucleotide（DPO）-based PCRwasdeveloped for the rapid detection of Staphylococcus aureus（SA）using Sa442 of SA as a target gene.DPO primers were able to efficiently amplify the target gene in a temperature range from 45℃to 65℃，indicating that theDPO-PCR method was not sensitive to the annealing temperature.The DPO-PCR sensitivity was 2.27×102cfu/m L.Because of a high specificity of DPO-PCR due to the special structures of DPO primers，no non-specific amplificationswere produced in reaction.In addition，13 positive samples for SA were detected from 175 clinical samplesby the DPO-PCRmethod，which was in accordance w ith the result by the SN/T 1870-2007 standard detection protocol.Therefore，the DPO-PCR could be used asa sensitive，rapid and simple tool.

Staphylococcus aureus，Sa442 gene，DPO-PCR

R 37

A

1673—1689（2016）04—0419—05

2014-11-23

海南省社会发展科技专项（2015SF29）；国家质检总局科技项目（2013IK031，2013IK051，2015IK089）；重庆市科技计划项目（cstc2014yykfA80017）；海南省应用技术研究与开发专项项目（ZDXM20130025）；广东检验检疫局科技计划项目（2013GDK04，2015GDK53）。

李丹丹（1979—），女，黑龙江哈尔滨人，农学博士，高级兽医师，主要从事病原微生物诊断与防治技术研究。E-mail：108074182@qq.com

徐义刚（1978—），男，吉林汪清人，农学博士，教授，博士研究生导师，主要从事病原微生物诊断与防治技术研究。E-mail：esta123@126.com