地塞米松对抗大鼠急性肺损伤的作用及其机制

符榕

(天津儿童医院，天津300000)



·基础研究·

地塞米松对抗大鼠急性肺损伤的作用及其机制

符榕

(天津儿童医院，天津300000)

目的观察地塞米松(Dex)对脂多糖(LPS)、抗盐酸(HCl)、LPS+HCl所致大鼠急性肺损伤的作用，并探讨其机制。方法将64只雄性SD大鼠随机分为NS组、LPS组、HCl组、LPS+HCl组、NS+Dex组、LPS+Dex组、HCl+Dex组、LPS+HCl+Dex组，每组8只。NS组大鼠尾静脉注射生理盐水0.6 mL。LPS组尾静脉注射LPS 8 mg/kg。HCl组气管内缓慢滴注 pH为1.8的盐酸2 mL/kg。LPS+HCl组先尾静脉注射LPS 4 mg/kg，4 h后气管内缓慢滴注pH为1.8的盐酸0.5 mL/kg。NS+Dex组、LPS+Dex组、HCl+Dex组、LPS+HCl+Dex组先分别按照NS组、LPS组、HCl组、LPS+HCl组方法给药，然后腹腔注射Dex 2 mg/kg。4 h后处死大鼠。取血采用ELISA法检测血清TNF-α、IL-4。取支气管肺泡灌洗液(BALF)离心，计数细胞沉淀中白细胞总数，取上清液用考马斯亮兰法检测蛋白总量，用ELISA法检测TNF-α、IL-4水平。取肺组织行病理学观察，并计算肺湿/干重比(W/D)，用RT-PCR检测肺组织中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)mRNA。结果与NS组相比，LPS组、HCl组、LPS+HCl组大鼠肺组织病理改变较重，肺W/D、BALF中白细胞总数及总蛋白含量升高，血清和BALF中TNF-α、IL-4升高，肺组织NE mRNA表达升高(P均<0.05)。上述指标LPS+Dex组低于LPS组，LPS+HCl+Dex组低于LPS+HCl组(P均<0.05)，HCl+Dex组和HCl组差异无统计学意义。结论Dex可对抗LPS、HCl、LPS+HCl所致大鼠急性肺损伤，其机制与降低NE有关。与LPS、LPS+HCl所致急性肺损伤相比，Dex对HCl所致大鼠急性肺损伤干预效果较差。

糖皮质激素；地塞米松；急性肺损伤；细胞因子；中性粒细胞弹性蛋白酶；盐酸；脂多糖

急性肺损伤可进行性加重发展为成人呼吸窘迫综合征(ARDS),危及患者生命，病死率高。其特征性表现是肺微血管通透性增加，弥漫性肺泡浸润，肺水肿以及严重低氧血症[1，2]。中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)对急慢性炎性疾病的组织和器官损伤有重要作用，已成为许多炎性疾病的治疗靶点。NE由活化的中性粒细胞分泌，在急性肺损伤的病理生理过程中发挥重要，肺组织NE表达与患者预后存在一定相关性[3]。糖皮质激素对不同诱因急性肺损伤的疗效差异很大，机制尚未阐明。2015年1～3月，我们分别用脂多糖(LPS)、盐酸(HCl)和LPS+HCl建立大鼠急性肺损伤模型，并用地塞米松(Dex)处理，观察Dex对不同原因导致的大鼠急性肺损伤的对抗作用，并探讨其机制。

1　材料与方法

1.1材料健康雄性SD大鼠64只，体质量250～300 g，购自河北医科大学动物中心。大肠杆菌LPS购自Sigma公司，地塞米松磷酸钠注射液购自石家庄制药厂，考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒购自南京建成生物公司，TNF-α、IL-4 ELISA检测试剂盒购自上海森雄科技实业有限公司(进口分装)，RT-PCR试剂盒购自Promega公司。β-actin引物序列上游5′-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3′，下游5′-ACCCTCATAGATGGGCACAG-3′，扩增片段长度115 bp；NE 引物序列上游5′-TCTCCACCGACCATCCAAC-3′，下游5′-GTCATGTCAGCAGCCCACTG-3′，扩增片段长度185 bp。

1.2动物分组及处理将64只雄性SD大鼠随机分为NS组、LPS组、HCl组、LPS+HCl组、NS+Dex组、LPS+Dex组、HCl+Dex组、LPS+HCl+Dex组，每组8只。正常对照组大鼠尾静脉注射生理盐水0.6 mL。LPS组尾静脉注射LPS 8 mg/kg。HCl组气管内缓慢滴注 pH为1.8的盐酸2 mL/kg。LPS+HCl组先尾静脉注射LPS 4 mg/kg，4 h后气管内缓慢滴注pH为1.8的盐酸0.5 mL/kg。NS+Dex组、LPS+Dex组、HCl+Dex组、LPS+HCl+Dex组先分别按照NS组、LPS组、HCl组、LPS+HCl组方法给药，然后腹腔注射Dex 2 mg/kg。4 h后处死大鼠。

1.3观测指标及方法

1.3.1肺组织形态学变化用4%甲醛固定右肺下叶24 h，行HE染色，普通光镜下观察肺组织病理改变。

1.3.2支气管肺泡灌洗液(BALF)中白细胞计数及蛋白总量测定钳夹左肺肺门，行气管插管，用4 ℃无菌生理盐水3 mL行左肺灌洗，反复3次，回收后用两层纱布过滤BALF，1 200 r/min、4 ℃离心10 min。取上清液用考马斯亮兰法检测蛋白总量。蛋白含量(g/L)=[(测定管吸光度-空白管吸光度)/(标准管吸光度-空白管吸光度)]×标准管浓度(g/L)。取细胞沉淀用血细胞计数板在光学显微镜下计数白细胞总数。

1.3.3肺组织湿/干比(W/D)测定先称量切下的右肺后叶和副叶湿重，然后将其置于烤箱80 ℃烘烤48 h，取出称量干重，计算W/D。

1.3.4血清、BALF中TNF-α、IL-4水平检测心脏穿刺取液，3 000 r/min、4 ℃下离心10 min，吸取上清，用ELISA法检测TNF-α、IL-4水平，操作按试剂盒说明书进行。同法检测BALF上清液中TNF-α、IL-4水平。

1.3.5肺组织NE mRNA检测取右肺前叶肺组织100 mg，TRIzol试剂抽提组织总RNA，取2 g总RNA，采用RT-PCR试剂盒合成cDNA，PCR 扩增反应条件为: 94 ℃预变性2 min，其后94 ℃变性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共25个循环，最后72 ℃延伸5 min。在2%琼脂糖凝胶中电泳，采用凝胶成像分析系统获取图像，测定电泳带吸光度值，以β-actin作为内参照，计算NE mRNA相对表达量。

2　结果

2.1各组肺组织形态学比较肉眼观NS组肺组织呈粉红色，无水肿、渗液、淤点淤斑。LPS组肺组织为暗红色，存在典型的出血及水肿。HCl组肺组织体积增大，出血和水肿也很明显，切面呈红色实变，有粉红色泡沫样液体流出。LPS+HCl组肺组织出血水肿更为明显，部分肺组织实变。NS+Dex组、LPS+Dex组、HCl+Dex组、LPS+HCl+Dex组病理改变与NS组、LPS组、HCl组、LPS+HCl组相比均有不同程度的减轻。光镜下观察NS组肺泡结构清晰，具有正常的肺泡隔。LPS组、HCl组和LPS+HCl组均有不同程度的肺组织破坏、毛细血管扩张、充血、肺泡隔增厚、大规模白细胞浸润、肺泡和间质水肿和出血、局灶性肺不张等。LPS组主要表现肺泡隔增厚和白细胞浸润；HCl组主要是气管上皮细胞脱落和肺泡水肿渗出；LPS+HCl组介于两组之间。NS+Dex组、LPS+Dex组、LPS+HCl+Dex组病理改变与NS组、LPS组、LPS+HCl组相比均有不同程度的减轻，HCl+Dex组和HCl组差异不明显。

2.2各组肺组织W/D比较各组肺组织W/D见表1。由表1可见，与NS组比较，LPS组、HCl组、LPS+HCl组肺组织W/D均升高(P均<0.05)。NS+Dex组肺组织W/D低于NS组，LPS+Dex组肺组织W/D低于LPS组，LPS+HCl+Dex组肺组织W/D低于LPS+HCl组(P均<0.05)，HCl+Dex组和HCl组肺组织W/D差异无统计学意义。

2.3各组BALF中白细胞总数、总蛋白含量比较各组BALF中白细胞总数、总蛋白含量见表1。由表1可见，与NS组比较，LPS组、HCl组、LPS+HCl组BALF中白细胞总数和总蛋白含量明显升高(P均<0.05)，且HCl组和LPS+HCl组均高于LPS组(P均<0.05)。上述指标NS+Dex组低于NS组，LPS+Dex组低于LPS组，LPS+HCl+Dex组低于LPS+HCl组(P均<0.05)，HCl+Dex组和HCl组差异无统计学意义。NS+Dex组、LPS+Dex组、LPS+HCl+Dex组、HCl+Dex组上述指标与NS组、LPS组、HCl组、LPS+HCl组相比均明显降低(P均<0.05)。

表1　各组肺组织W/D和BALF中白细胞总数、总蛋白含量比较±s)

注：与NS组比较，*P<0.01；与NS+Dex组比较，△P<0.05；与LPS 组比较，▲P<0.05；与HCl组比较，▼P<0.05；与LPS+HCl组比较，#P<0.05；与LPS+Dex组比较，※P<0.05。

2.4各组血清和BALF中TNF-α、IL-4比较各组血清和BALF中TNF-α、IL-4见表2。由表2可见，与NS组比较，LPS组、HCl组、LPS+HCl组血清和BALF中TNF-α、IL-4升高(P均<0.05)；上述指标NS+Dex组低于NS组，LPS+Dex组低于LPS组，LPS+HCl+Dex组低于LPS+HCl组(P均<0.05)，HCl+Dex组和HCl组差异无统计学意义。

表2　各组血清和BALF中TNF-α、IL-4比较

注：与NS组比较，*P<0.01；与LPS组比较，▲P<0.05；与LPS+HCl组比较，#P<0.05；与NS+Dex组比较，△P<0.05；与HCl+Dex组比较，■P<0.05。

2.5各组肺组织NE mRNA比较各组肺组织NE mRNA见表3。与NS组比较，LPS组、HCl组、LPS+HCl组肺组织NE mRNA表达均升高(P均<0.05)；NS+Dex组肺组织NE mRNA低于NS组，LPS+Dex组肺组织NE mRNA低于LPS组，LPS+HCl+Dex组肺组织NE mRNA低于LPS+HCl组(P均<0.05)，HCl+Dex组和HCl组肺组织NE mRNA差异无统计学意义。

表3　各组肺组织NE mRNA比较

注：与NS组比较，*P<0.01；与NS+Dex组比较，△P<0.05；与LPS组比较，▲P<0.01；与LPS+HCl组比较，#P<0.05。

3　讨论

急性肺损伤是临床常见危重症，也是多脏器功能障碍(MODS)或全身炎症反应综合征(SIRS)时最先出现的组织损伤。内毒素、失血性休克、缺氧、外伤、烧伤、缺血再灌注及机械通气等因素均可造成肺损伤，还可以放大肺损伤中的炎症反应过程，引起严重的肺功能障碍，因此急性肺损伤发病率和病死率较高[4]。肺是SIRS的主要靶器官，失控的炎症反应是急性肺损伤的本质，其特征表现为活化的中性粒细胞的大量浸润、毛细血管的通透性增加、弥漫性肺泡损伤、高水平活性氧和蛋白酶释放，从而导致肺泡内水肿、纤维蛋白沉积、透明膜形成和Ⅰ型肺泡上皮细胞的破坏。临床表现上为顽固低氧血症，PaO2/FiO2下降，胸片示双侧肺浸润，肺顺应性下降[5]。临床上，直接和间接的肺损伤均可导致ARDS，肺内直接原因包括胃内容物吸入、肺炎，肺外间接原因包括败血症、失血性休克、严重创伤、输血或胰腺炎[6]。研究表明，脓毒症是急性肺损伤发展的最高危因素，胃内容物误吸仅次于脓毒血症[7]。人类急性肺损伤的发生和发展是非常复杂的，很少由单一因素引起。相比LPS或者HCl一次打击模型，LPS+HCl二次打击模型更能准确地代表患者常见的病理状态。本研究建立了LPS尾静脉注射和HCl气管滴入的一次打击模型以及LPS+HCl二次打击模型，来模拟脓毒症和(或)误吸导致的急性肺损伤甚至ARDS，探讨细胞因子及NE在不同诱因急性肺损伤患者肺组织和血液中的表达及激素干预效果。

肺组织病理学检查所见、肺组织W/D和BALF中总蛋白含量是反映肺损伤程度的经典指标。本研究LPS、HCl、LPS+HCl组光镜下可见到相似的病理改变，如肺组织破坏。LPS组有大量炎细胞浸润，间质水肿、毛细血管淤血更明显，肺泡隔增厚。HCl组以肺泡腔内改变为主，多见气管上皮脱落，肺泡腔大量水肿液渗出，可合并肺泡出血导致肺实变。而LPS+HCl组纤维蛋白渗出、炎细胞浸润均可多见，但上皮脱落轻于HCl组。LPS、HCl、LPS+HCl组肺W/D和BALF中总蛋白含量均高于NS组，表明HCl吸入直接引起的上皮和内皮细胞损伤较严重，肺泡微血管通透性进一步增加，富含蛋白质的水肿液大量渗出，导致明显的肺水肿。近年来研究表明，中性粒细胞是急性肺损伤炎症反应中重要的效应细胞。中性粒细胞激活和招募在急性肺损伤的发生进展中起着重要作用[8]。中性粒细胞是数量最多的人免疫细胞，在天然免疫防御中起重要作用，形成抵御微生物入侵的第一线。中性粒细胞被迅速激活，黏附到血管壁或者聚集到靶器官加重微循环障碍(通常肺是第一个目标)，可导致和加重急性肺损伤，是急性炎症反应的主要环节。活化的中性粒细胞可释放多种细胞毒性物质，包括活性氧和蛋白酶，参与炎症反应的调节[9，10]。抑制和消除局部的中性粒细胞可能会减弱急性肺损伤。本研究结果显示，LPS、HCl、LPS+HCl组BALF中白细胞总数明显高于对照组。

炎症介质、细胞因子介导的全身炎症级联反应是导致急性肺损伤的重要机制[11～13]。促炎因子水平可以反映急性肺损伤或ARDS的严重程度。TNF-α是最重要的致炎细胞因子, 也是多种细胞因子的启动因子。肺局部炎症可激活炎性细胞，活化或启动促炎细胞因子(如 IL-1β、IL-8)。TNF-α反过来可直接损伤肺血管内皮细胞，增加内皮细胞的通透性，造成肺水肿，同时能刺激中性粒细胞释放炎性介质，引起炎症级联反应，加重肺损伤[14，15]。本研究结果显示，LPS、HCl、LPS+HCl组血清和BALF中TNF-α均较NS组升高。 IL-4是新发现的抗炎因子，可抑制TNF-α的生成，在炎症反应中主要起抗感染和免疫抑制作用[16]。促炎因子和抑炎因子失衡是急性肺损伤发生发展的重要原因。在急性肺损伤中炎性因子和抑炎因子含量均增加，但抑炎因子含量相对较低，且时间滞后[17]。

NE是储存于中性粒细胞胞质中的丝氨酸蛋白酶，属于糜蛋白酶家族，位于体液性介质网络的下游，它结合活性氧以帮助吞噬溶酶体降解吞噬的微生物，消化和降解细胞外基质组分及上皮连接结构，不仅可引起直接组织损伤，同时也放大炎性反应，刺激中性粒细胞趋化因子的合成和释放，有助于中性粒细胞趋化、迁移。被招募激活的中性粒细胞脱颗粒，释放出更多的蛋白酶，触发瀑布样级联反应，引起持续的炎症反应[18，19]。这种促炎反应并不局限于肺，也可延伸进入体循环，导致SIRS和MODS。NE是监测急性肺损伤或ARDS进展的指标，可用来判断急性肺损伤患者的预后。抑制NE可改善急性肺损伤患者的结局，防治急性肺损伤后肺纤维化。NE抑制剂已被推荐用于急性肺损伤的治疗[20，21]。研究表明，NE抑制剂具有治疗纤维增生阶段急性肺损伤或ARDS的能力[22]。本研究发现，LPS、HCl、LPS+HCl组肺组织NE mRNA与NS组相比升高。与以往研究结果符合[23，24]。

Dex是一种常用糖皮质激素，能稳定细胞膜，抑制促炎细胞因子的释放，有镇静、止痛和抗交感神经作用[25，26]。由于其较强的抗炎效应，Dex在急性肺损伤或ARDS中已经得到广泛的应用，但在临床应用中，Dex的适应证、剂量和疗程仍有很大争议。本研究结果显示，Dex可以对抗LPS和LPS+HCl所致的肺损伤，但对HCl所致肺损伤效果较差，说明Dex对不同原因导致的急性肺损伤的治疗作用存在差异，这可能受疾病种类、肺内外部炎症反应、肺损伤发病机制等因素影响。笔者推测其机制可能与Dex抑制TNF-α等促炎细胞因子的表达和释放、抑制中性粒细胞脱颗粒、改善急性肺损伤时的Th1/Th2细胞比例有关[ 27～29]。另外Dex可以抑制急性肺损伤时肺组织NE的释放，从而改善局部蛋白酶-抗蛋白酶的失衡，对抗急性肺损伤。

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