雷米普利对慢性心衰大鼠肾间质纤维化及PDGF-B、CTGF表达的影响

周静,杨晓鸥,张梦云,李秀华,徐婧,谢亚芹

(1承德医学院附属医院，河北承德 067000；2承德医学院)



雷米普利对慢性心衰大鼠肾间质纤维化及PDGF-B、CTGF表达的影响

周静1,杨晓鸥1,张梦云1,李秀华1,徐婧1,谢亚芹2

(1承德医学院附属医院，河北承德 067000；2承德医学院)

目的观察雷米普利对慢性心力衰竭大鼠肾间质纤维化及肾组织血小板源生长因子B(PDGF-B)、结缔组织生长因子(CTGF)表达的影响。方法 将30只雄性Wistar大鼠随机分为假手术组(A组)、模型组(B组)和雷米普利组(C组)各10只。B、C组大鼠通过肾上腹主动脉部分缩窄法建立大鼠慢性心力衰竭模型，A组大鼠只分离肾上腹主动脉而不结扎。术后C组大鼠给予雷米普利1 mg/(kg·d)灌胃，A、B两组大鼠给予等量生理盐水灌胃，常规喂养4周。取各组大鼠肾组织行HE、Masson染色观察病理变化，用免疫组化法检测各组肾脏组织中PDGF-B、CTGF蛋白表达，用RT-PCR法检测各组大鼠肾脏组织中PDGF-B、CTGF mRNA表达。结果与A组相比, B、C组大鼠肾脏出现明显纤维化改变，其中C组纤维化病变程度较B组轻。B、C组大鼠PDGF-B、CTFG 蛋白和mRNA表达均高于A组，且B组高于C组(P均<0.01)。结论 雷米普利可降低心衰大鼠肾间质纤维化程度及肾组织PDGF-B、CTFG表达。

心力衰竭；雷米普利；肾脏纤维化；血小板源性生长因子；结缔组织生长因子

Effects of ramipril on renal interstitial fibrosis, expression of

PDGF-B and CTGF in rats with chronic heart failure

慢性心力衰竭的发展过程中多伴有肾脏功能损害，肾脏功能损害又会加重心力衰竭的程度，并严重影响心衰患者的预后[1,2]。因此，预防心衰患者的肾脏损害对于心衰患者的治疗及预后都有重要的临床意义。血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)已被广泛用于心脏病的治疗[3]，但ACEI延缓心衰大鼠肾脏纤维化进程的研究却很少。大量研究表明, 血小板源性生长因子B(PDGF-B)表达在肾脏纤维化形成中起重要作用[4]；结缔组织生长因子(CTGF)通过自身或介导其他因子的作用，在肾脏纤维化的形成过程中起着至关重要的作用[5]。2014年9月～2016年1月，我们用雷米普利干预慢性心力衰竭大鼠，观察其对心衰大鼠肾间质纤维化程度及肾组织纤维化细胞因子PDGF-B、CTGF表达的影响。现报告如下。

1　材料与方法

1.1实验动物分组与处理实验对象为30只雄性SPF级Wistar 大鼠，10周龄，体质量190～210 g,购于北京维通利华实验动物技术有限公司。将其随机分为假手术组(A组)、模型组(B组)、雷米普利组(C组)，各10只。B、C组大鼠手术分离腹主动脉和肾动脉后，在肾动脉上方约1 cm 处半结扎腹主动脉，而A组分离出腹主动脉后不结扎直接关腹。30只大鼠在术后连续3 d予青霉素20万单位腹腔注射，术后常规喂养。3周后，与假手术组相比，B组及C组大鼠开始出现平均尿量减少; 喂养4 周后，B组和C组出现呼吸急促、活动及食量减少、爪背及尾巴发绀和水肿等临床症状。以左心室舒张末压(LVEDP)≥15 mmHg作为心力衰竭成模标准，经检测B、C组大鼠成功建立慢性心力衰竭模型。然后，C组大鼠给予雷米普利1 mg/(kg·d)，A、B组大鼠给予等量生理盐水灌胃。实验期间大鼠均以普通混合饲料分笼喂养，连续4周。给药4周后，开腹取出大鼠的左侧肾脏组织3份待测。

1.2肾间质纤维化观测方法取各组大鼠肾组织HE染色行肾组织形态学观察。行Masson染色观察肾组织胶原沉积情况，蓝绿色染为阳性表现，每组随机选取10张切片，每张切片取4 个不同视野，计算阳性染色面积与整个视野面积的比值，取平均值，为相对间质容积。

1.3肾组织PDGF-B、CTGF蛋白表达检测方法采用免疫组化法。操作按试剂盒说明书进行。以PBS代替一抗作为阴性对照。阳性表现为棕黄色染色。各组随机选取10张切片，每张切片取4个视野，采用MiVnt图像分析系统计算各组阳性染色面积，结果以像素单位表示。

1.4肾组织PDGF-B、CTGF mRNA检测方法采用RT-PCR法。提取肾脏组织中总RNA ，并检测总RNA的浓度和纯度。取2 μg 总RNA为模板逆转录成cDNA。PDGF-B上游引物5′-CTGAGCTGGACTTGAACATGA-3′，PDGF-B下游引物5′-CACTACTGTCTCACACTTGCAGG-3′，扩增片断长度380 bp,退火温度60 ℃；CTGF上游引物5′-CTGTTCTAAGACCTGTGGGATGG-3′，下游引物5′-GTCCCTTACTCCCTGGCTTTACG-3′，扩增片断长度445 bp，退火温度56 ℃；β-肌动蛋白(β-actin)上游引物5′-GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3′,下游引物5′-CATCTGCTGGAAGGTGGACA-3′；扩增片断长度452 bp,退火温度58 ℃。 PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳(含0．5 mg/L Goldview)，采用ZF型紫外透射反射分析仪摄像，采用Quantity One 4.6.2图像分析软件进行灰度扫描，以β-actin为内参照，各组肾组织PDGF-B、CTGF mRNA相对表达量用目的条带灰度值和内参照条带灰度值之比表示。

2　结果

2.1各组肾脏形态学改变比较HE染色可见A组大鼠肾脏形态正常,B组大鼠肾小球、肾小管和肾间质均有大量胶原纤维沉积，肾小管明显扩张,间质增厚。C组大鼠的肾小管轻度扩张，肾小管及间质内可见微量胶原纤维沉积。Masson染色可见A组大鼠肾小管间质无明显蓝绿色染胶原纤维；B组大鼠肾小管间质可见明显绿染的胶原纤维；C组大鼠肾小管间质的蓝绿色染色程度轻于B组而重于A组。对Masson 染色进行胶原半定量分析结果发现，C组的相对间质容积为11.57%±0.82%，高于A组的3.97%±0.32%，低于B组的33.80%±2.54%，P均<0.01。

2.2各组肾组织PDGF-B、CTFG蛋白表达比较 PDGF-B免疫组化染色A组大鼠肾小管细胞、肾小球细胞胞质内可见少量棕黄色染色，为弱阳性；B组大鼠黄染程度明显强于其他两组；C组大鼠肾组织的黄染程度重于A组，而轻于B组。三组大鼠肾组织PDGF-B阳性染色面积见表1。CTGF免疫组化染色A组大鼠肾小管内可见极少量棕黄色染色，呈弱阳性；B组大鼠肾小管上皮细胞和肾间质区可见大量黄染区，呈强阳性；C组大鼠仅肾小管上皮细胞内可见少量黄染区，呈阳性，其黄染程度比B组大鼠轻。三组大鼠肾组织CTGF阳性染色面积见表1。

2.3各组肾组织PDGF-B、CTFG mRNA表达比较三组大鼠肾组织PDGF-B、CTFG mRNA表达见表1。

表1　各组大鼠肾组织中CTGF和PDGF-B蛋白及基因表达量的比较 ±s)

注：与A组比较，*P<0.01；与B组比较，#P<0.01。

3　讨论

本研究结果显示，B组大鼠肾组织纤维化程度明显重于A组，说明慢性心力衰竭会导致肾脏纤维化。其机制为慢性心力衰竭后，肾灌注急剧减少，从而激活肾素-血管紧张素-醛固酮系统，使血管紧张素(Ang)Ⅱ水平升高。一方面，AngⅡ可促进转化生长因子β1(TGF-β1)、CTGF、PDGF等促纤维化因子合成，三者相互作用从而引起或加重肾纤维化[6,7]；另一方面，Ang Ⅱ通过激活NADPH氧化酶产生大量的活性氧，活性氧又作为Ang Ⅱ的信号分子介导Ang Ⅱ的致纤维化作用，造成肾间质纤维化[8]。本研究B组大鼠肾组织PDGF-B和CTGF的表达量明显高于A组，证实PDGF-B和CTGF与肾脏纤维化密切相关。PDGF-B具有化学激活、致增生和硬化等作用，主要通过激活肾固有细胞增殖，诱导肾小管和间质细胞转分化以及细胞外基质(ECM)积聚，激活其他致肾脏纤维化因子，促进ECM积聚和抑制ECM降解等机制导致肾间质纤维化形成[10，11]。CTGF是促纤维化和ECM积聚的重要细胞因子，也是介导TGF-β1诱发肾间质纤维化的重要效应因子[12，13]。通过多种途径参与ECM的积聚，进而加重肾脏纤维化的程度。

本研究C组大鼠肾组织纤维化程度和PDGF-B、CTGF表达均低于B组，表明雷米普利能通过下调细胞因子PDGF-B、CTGF的表达来延缓肾脏纤维化的进程。雷米普利是新一代强效和长效ACEI,有非降压依赖性肾保护作用,雷米普利通过竞争性抑制血管紧张素酶，阻断Ang Ⅰ向AngⅡ的转化，从而显著减少AngⅡ的生成，进而下调TGF-β1、CTGF、PDGF等一系列细胞因子的表达，减少肾组织中Ⅰ～Ⅲ型胶原沉积，对肾纤维化起到抑制作用[14～15]。此外雷米普利还可以通过减少肾素的分泌，阻止肾脏纤维化的发展。综上所述，心力衰竭患者如早期应用雷米普利，能有效抑制肾脏纤维化的进展，从而对肾脏进行保护，最终达到减轻心衰患者的痛苦，改善患者预后的目的。

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ZHOUJing1,YANGXiaoou,ZHANGMengyun,LIXiuhua,XUJing,XIEYaqin

(1ChengdeMedicalCollege,Chengde067000,China)

ObjectiveTo observe the effects of ramipril on the renal interstitial fibrosis, expression of platelet derived growth factor (PDGF-B) and connective tissue growth factor (CTGF) in the renal tissues of rats with chronic heart failure. MethodsThe 30 male Wistar rats were randomly divided into the Sham group (group A, 10 rats), model group (group B,10 rats) and the ramipril group (group C,10 rats). The chronic heart failure model was established by the renal upper abdominal aorta coarctation. After the model was successfully established, the rats in the group C were administrated with 1 mg/(kg·d) ramipril for 4 weeks, while rats in groups A and B were administrated with normal saline for 4 weeks. The degree of renal fibrosis was detected under light microscope by HE and Masson staining. The protein and mRNA expression levels of PDGF-B and CTGF were respectively detected by immunohistochemistry and RT-PCR.ResultsCompared with group A, the renal fibrosis was significantly found in the groups B and C, and group B was more severe than the group C. The protein and mRNA expression levels of PDGF-B and CTGF were significantly higher in the groups B and C than that those of group A, and moreover, group B was higher than group C (allP<0.01). ConclusionRamipril can effectively decrease the renal interstitial fibrosis, expression levels of PDGF-B and CTGF in rats with chronic heart failure.

heart failure; ramipril; renal fibrosis; platelet-derived growth factor; connective tissue growth factor

河北省卫计委科研基金资助项目(20110180)。

周静(1991-),女,硕士研究生,主要研究方向为慢性心力衰竭的病理生理。E-mail: 285738956@qq.com

简介：李秀华(1967-) ,女,博士,副主任医师,硕士生导师,主要研究方向为老年心血管 病、老年心力衰竭的诊治及病理生理。E-mail: lixiuhua76@ 126. com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.26.003

R692.5

A

1002-266X(2016)26-0010-03

2016-02-13)